韓晶 趙天淼 李丹

(武警吉林省總隊醫(yī)院,吉林 長春 130052)

癲癇是一種由于大腦神經(jīng)元異常放電所引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常的腦部疾病，臨床上主要表現(xiàn)為動作的反復(fù)性、不可預(yù)知性，同時病程長，致殘率高〔1，2〕。目前研究認為“神經(jīng)-免疫-細胞因子”網(wǎng)絡(luò)能夠顯著影響中樞神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放，特別是細胞因子與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)〔3，4〕。其中白細胞介素(IL)-1β作為一種重要的細胞因子，在癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生過程中與其受體相結(jié)合，進一步加劇神經(jīng)細胞的興奮〔5～7〕。左乙拉西坦是第二代癲癇治療藥物，能夠通過調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)分泌，影響受體型鈣離子釋放，調(diào)控電壓門控鈉通道改變癲癇點射，被較為廣泛應(yīng)用于癲癇的治療〔8～10〕。但左乙拉西坦對癲癇的治療作用目前集中于體內(nèi)動物實驗研究，具體相關(guān)機制報道較少，因此本研究將通過IL-1β誘導(dǎo)PC12細胞復(fù)制體外癲癇模型，探討左乙拉西坦對IL-1β誘導(dǎo)的PC12細胞損傷的影響及相關(guān)機制。

1 材料和方法

1.1細胞株 大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細胞株P(guān)C12購于中國科學(xué)院細胞庫。

1.2試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，IL-1β均購于美國Gibco公司；兔抗人MyD88，NF-κB p65，p-NF-κB p65及GAPDH多克隆抗體，腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6檢測試劑盒購于美國Abcam公司；Annexin V-FITC/PI流式雙染試劑盒，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒，細胞周期檢測試劑盒均購于南通碧云天生物技術(shù)有限公司；一氧化氮(NO)測定試劑盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司。ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司；FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司；MK3酶標儀購自美國Thermo公司。

1.3噻唑藍(MTT)法檢測PC12細胞活力 將5×103個PC12細胞接種到6孔板，待細胞貼壁后，加入0，3，10，30，100，300 μmol/L的左乙拉西坦作用細胞48 h，加入MTT孵育4 h后將上清液甩掉，后加入150 μl的二甲基亞砜，震蕩使結(jié)晶物溶解，測定吸光值。

1.4細胞分組 將處于對數(shù)生長期的PC12細胞隨機分為正常對照組，IL-1β組，左乙拉西坦低、中、高濃度組，除正常對照組外，其余組細胞均預(yù)先給予10 ng/ml的IL-1β孵育24 h進行模型構(gòu)建，后左乙拉西坦再分別給予10，30，100 μmol/L的左乙拉西坦培養(yǎng)48 h，正常對照組，IL-1β組分別給予等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)培養(yǎng)48 h。采用MTT法檢測各組細胞活力。

1.5Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡 將9×103個PC12細胞接種到6孔板，待細胞貼壁后，按1.4分組并給藥48 h后，每組收集1×105/ml個細胞，加入結(jié)合緩沖液混勻后，繼續(xù)加入Annexin V-FITC及PI并混勻，1 h內(nèi)上流式細胞儀進行細胞凋亡檢測并分析。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測TNF-α、IL-6含量 將 9×103個PC12細胞接種到6孔板，待細胞貼壁后，按1.4分組并給藥48 h后，胰蛋白酶裂解細胞并收集蛋白，嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測細胞中TNF-α、IL-6含量。

1.7比色法檢測NO含量 將9×103個PC12細胞接種到6孔板，待細胞貼壁后，按1.4分組并給藥48 h后，裂解細胞，按照檢測試劑盒說明書檢測NO含量。

1.8RT-PCR法檢測MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白mRNA表達 根據(jù)Trizol法提取細胞中總RNA，并檢測總RNA的完整性及純度，當OD260/OD280>1.6說明RNA純度良好，接著利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄并得到cDNA，最后進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.9Western印跡檢測細胞中MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達 將9×103個PC12細胞接種到6孔板，待細胞貼壁后，收集細胞并裂解得到細胞總蛋白，測定蛋白濃度。制作濃縮膠和分離膠，蛋白上樣后，進行凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂奶粉封閉1 h后，一抗4℃過夜孵育，二抗室溫孵育1 h，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進行F及t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度的左乙拉西坦對PC12細胞活力的影響 0，3，10，30，100，300 μmol/L的左乙拉西坦處理PC12細胞48 h后，與0 μmol/L左乙拉西坦處理組(0.43±0.04)比較，10，30，100 μmol/L的左乙拉西坦能顯著的提高PC12細胞活力(0.49±0.05，0.57±0.05，0.66±0.06，P<0.01)，而3 μmol/L(0.42±0.04)的左乙拉西坦對PC12細胞活力無影響，300 μmol/L(0.41±0.05)的左乙拉西坦降低PC12細胞活力(P<0.01)。

2.2左乙拉西坦對IL-1β誘導(dǎo)的PC12細胞活力的影響 與正常對照組(0.43±0.04)比較，IL-1β組(0.35±0.03)細胞活力顯著降低(P<0.01)；與IL-1β組比較，左乙拉西坦低(0.38±0.03)、中(0.42±0.04)、高濃度組(0.48±0.05)細胞活力顯著上升(P<0.01)。

2.3左乙拉西坦對IL-1β誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的影響 與正常對照組比較，IL-1β組細胞凋亡率顯著提高(P<0.01)；與IL-1β組比較，左乙拉西坦低、中、高濃度組細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。見表1。

2.4左乙拉西坦對IL-1β誘導(dǎo)的PC12細胞中炎癥因子水平的影響 與正常對照組比較，IL-1β組細胞中TNF-α、IL-6及NO含量顯著提高(P<0.01)；與IL-1β組比較，左乙拉西坦低、中、高濃度組細胞中TNF-α、IL-6及NO含量顯著降低(P<0.01)。見表2。

表1 左乙拉西坦對PC12細胞凋亡的影響

與正常對照組比較：1)P<0.01；與IL-1β組比較：2)P<0.01，下表同

表2 左乙拉西坦對IL-1β誘導(dǎo)的PC12細胞中TNF-α、IL-6及NO含量的影響

2.5左乙拉西坦對IL-1β誘導(dǎo)的PC12細胞中MyD88，p-NF-κB p65 mRNA表達量的影響 與正常對照組比較，IL-1β組細胞中MyD88，p-NF-κB p65 mRNA表達量顯著提高(P<0.01)；與IL-1β組比較，左乙拉西坦低、中、高濃度組細胞中MyD88，p-NF-κB p65 mRNA表達量顯著降低(P<0.01)。見圖1、表3。

A：正常對照組；B：IL-1β組；C：左乙拉西坦低濃度組；D：左乙拉西坦中濃度組；E：左乙拉西坦高濃度組；圖2同圖1 左乙拉西坦對IL-1β誘導(dǎo)的PC12細胞中MyD88，p-NF-κB p65 mRNA表達量的影響

表3 左乙拉西坦對IL-1β誘導(dǎo)的PC12細胞中MyD88，p-NF-κB p65 mRNA及蛋白表達量的影響

2.6左乙拉西坦對IL-1β誘導(dǎo)的PC12細胞中MyD88，NF-κB 65蛋白表達量的影響 與正常對照組比較，IL-1β組細胞中MyD88，p-NF-κB p65 蛋白表達量顯著提高(P<0.01)；與IL-1β組比較，左乙拉西坦低、中、高濃度組細胞中p-NF-κB p65 蛋白表達量顯著降低(P<0.01)，左乙拉西坦中、高濃度組細胞中MyD88蛋白表達量顯著降低(P<0.01)。見表3、圖2。

圖2 左乙拉西坦對IL-1β誘導(dǎo)的PC12細胞中MyD88，NF-κB 65蛋白表達量的影響

3 討 論

細胞因子是“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫”網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的重要介質(zhì)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)能夠分泌多種細胞因子，而這些細胞因子作為免疫介質(zhì)影響著神經(jīng)細胞功能〔3，4〕。癲癇作為一種與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，細胞因子的合成、分泌與癲癇的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔5～7〕。IL-1β作為一種重要的細胞因子，通過與神經(jīng)細胞膜上的受體ILRⅠ結(jié)合，進而激活下游信號通路，如激活NF-κB、MAPK信號通路發(fā)揮長效作用，激活PI3K、Src信號通路發(fā)揮短效作用〔5～7〕。因此本研究將以IL-1β作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)PC12細胞損傷作為癲癇體外細胞模型。左乙拉西坦是一種常見的二代抗癲癇藥物，研究認為左乙拉西坦主要是通過調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)與SV2A的釋放，影響IP3受體依賴性鈣釋放，或者通過調(diào)控電壓門控鈉通道達到治療癲癇的目的〔8～10〕。

本研究參考IL-1β在其他正常細胞中的劑量濃度并結(jié)合預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)10 ng/ml是IL-1β誘導(dǎo)PC12細胞損傷的最適濃度〔11，12〕。另外Stettner等〔13〕研究表明1.5、15.0、150.0 μmol/L左乙拉西坦能顯著提高脂多糖誘導(dǎo)的Schwann細胞膜電位，同時能提高細胞的抗氧化、抗凋亡、抗炎等功能。Sendrowski等〔14〕采用高溫損傷體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10、50 μmol/L左乙拉西坦能顯著抑制神經(jīng)元熱損傷，而300 μmol/L左乙拉西坦反而加劇損傷。本研究結(jié)果表明左乙拉西在10，30，100 μmol/L劑量范圍內(nèi)對PC12細胞活力具有促進作用，同時此濃度范圍也與Stettner等〔13，14〕，結(jié)果較為一致。本研究結(jié)果表明左乙拉西坦能顯著提高IL-1β誘導(dǎo)的PC12細胞活力，并降低細胞凋亡率，提示左乙拉西坦能夠抵抗IL-1β誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡。

癲癇發(fā)作時候能夠誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元分泌大量的IL-1β，IL-1β與其受體ILRⅠ結(jié)合后，能夠誘導(dǎo)附屬蛋白附著，同時招募接頭蛋白MyD88到ILRⅠ的結(jié)構(gòu)域，進而激活NF-κB信號通路〔5～7〕。NF-κB是一種具有多種調(diào)節(jié)功能的核因子，在靜息條件下與IκB形成復(fù)合物靜置于細胞質(zhì)中，當受到上游細胞因子如脂多糖，IL-1β激活后，上游的IκB激酶被活化，促使IκB磷酸化并與NF-κB p65亞基解離，使p65進入細胞核，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB被激活后，能促使大量的炎癥因子分泌(TNF-α、IL-6及NO)，使這些炎癥因子反過來加重癲癇。研究已經(jīng)顯示癲癇發(fā)生過程中MyD88/NF-κB信號通路被高度激活，同時伴隨著大量炎癥因子(TNF-α、IL-6及NO)的分泌〔5～7，15〕。因此抑制炎癥因子的分泌能一定程度上減少癲癇引起的腦組織損傷。本研究結(jié)果表明乙拉西坦能顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的PC12細胞中TNF-α、IL-6及NO的釋放，并下調(diào)MyD88、p-NF-κB p65的表達。