梁子聰 王恒 胡建山 陸瑞娜 胡先運(yùn)

(1黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，貴州 都勻 558000；2黔南州中醫(yī)醫(yī)院；3黔南州人民醫(yī)院；4貴州醫(yī)科大學(xué)天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

骨關(guān)節(jié)炎(OA) 是中老年人常見(jiàn)的致殘性疾病之一，全身各關(guān)節(jié)均可發(fā)病，其中膝關(guān)節(jié)發(fā)病率最高〔1〕。目前我國(guó)膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA) 總體發(fā)病率約為18%，女性(約19%)高于男性(約11%)〔2〕。KOA的病因病機(jī)復(fù)雜，有研究顯示，KOA的發(fā)病與核因子(NF)-κB信號(hào)通路的激活關(guān)系密切，它通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)，調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)，參與了KOA發(fā)病的免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)、滑膜成纖維細(xì)胞增生、軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解、軟骨細(xì)胞凋亡等多個(gè)環(huán)節(jié)〔3，4〕。KOA的早期治療以抗炎、鎮(zhèn)痛為主，但長(zhǎng)期服用非甾體類抗炎藥會(huì)帶來(lái)諸多不良反應(yīng)〔5〕。中醫(yī)藥治療KOA的療效良好，副作用少，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。黔南州中醫(yī)醫(yī)院研制的院內(nèi)制劑鹿角壯骨膠囊，用于治療因肝腎不足引起的KOA已獲得不錯(cuò)的臨床效果〔6〕。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察鹿角壯骨膠囊對(duì)NF-κB通路的影響，了解其對(duì)KOA的治療作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1儀器 JA10002型電子天平(上海精天)；DDIL-5型恒溫箱(上海安亭)；ASP300 S型全封閉式組織脫水機(jī)、RM2265型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、HI1210型攤片機(jī)、DM750型光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica)；GelDoc型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD)。

1.2藥品與試劑 治療藥物鹿角壯骨膠囊由黔南州中醫(yī)醫(yī)院制劑科提供(批準(zhǔn)文號(hào)：黔藥制2013003號(hào)，規(guī)格：0.45 g/粒)，木瓜蛋白酶(北京索萊寶)，封閉液(武漢博士德)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-2α、NF-κB抑制蛋白(IκBα)、NF-κB p65、骨橋蛋白(OPN)一抗，通用型SP試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色盒(北京中杉金橋)，4%多聚甲醛、二甲苯、乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液由黔南州人民醫(yī)院病理科提供，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 普通級(jí)四月齡日本長(zhǎng)耳白雌兔24只，體重(2.0±0.5)kg，由長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0010。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，分籠飼養(yǎng)，不限制飲食。24只兔隨機(jī)分為3組，分別為正常組、模型組、治療組(鹿角壯骨膠囊)，每組8只。

1.4造模 各組兔按3.5 ml/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，待完全麻醉后，剪刀于右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)附近備皮，顯露皮膚，碘伏、75%酒精棉簽反復(fù)消毒。1 ml注射器抽取提前配制好的4%木瓜蛋白酶溶液0.5 ml，微微彎曲膝關(guān)節(jié)，針尖分別在模型組與治療組兔內(nèi)側(cè)膝眼進(jìn)針，回抽確定進(jìn)入關(guān)節(jié)腔后，緩慢注射，棉簽輕壓針眼，避免溶液溢出。正常組同法注射等體積滅菌注射用水。各組被動(dòng)屈伸右側(cè)膝關(guān)節(jié)20次，促進(jìn)溶液在關(guān)節(jié)腔內(nèi)均勻擴(kuò)散。間隔3 d重復(fù)一次，共注射3次。末次注射后，各組兔每天驅(qū)趕運(yùn)動(dòng)30 min，其余時(shí)間籠內(nèi)自由活動(dòng)。

1.5治療方法 首次注射后第2周，治療組給予鹿角壯骨膠囊藥粉0.3 g/kg(參照成人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等效劑量〔7〕換算而得)，稱取體重的相應(yīng)劑量，用蒸餾水稀釋成10 ml后灌胃，每天1次，連續(xù)給藥4 w。余組給予10 ml蒸餾水灌胃。

1.6動(dòng)物取材 末次給藥第2天，麻醉處死所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。切開(kāi)關(guān)節(jié)囊，剔除軟組織，取下膝關(guān)節(jié)及滑膜標(biāo)本，膝關(guān)節(jié)標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定，滑膜組織置于液氮冷凍保存。

1.7觀察指標(biāo)

1.7.1各組兔膝關(guān)節(jié)滑膜IκBα、NF-κB p65、OPN蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western印跡法檢測(cè)各組兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織IkBα、NF-κB p65、OPN蛋白表達(dá)的情況。將滑膜標(biāo)本剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小，細(xì)胞裂解法提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，收集上清液，提取等量蛋白，配置十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉，加入IκBα(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、OPN(1∶500)、β-actin(1∶2 000)一抗，4℃室溫?fù)u床過(guò)夜，37℃復(fù)溫后加二抗(1∶1 000)孵育2 h，TBST漂洗，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，用β-actin做內(nèi)參，Image J軟件計(jì)算條帶灰度值(目的蛋白相對(duì)含量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值)。

1.7.2各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨VEGF、HIF-2α、NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫組化法(SP)檢測(cè)各組兔軟骨組織VEGF、HIF-2α、NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)的情況。按照免疫組化檢測(cè)試劑說(shuō)明書操作：石蠟切片經(jīng)60℃烘片1 h，入二甲苯脫蠟2次，每次10 min、梯度酒精(100% 3 min，90% 3 min，85% 3 min，75% 3 min，蒸餾水3 min，PBS 3 min)。將切片置于0.1 mol/L且pH=6.0的枸櫞酸液修復(fù)液中，用微波爐100火力3 min至微微沸騰，再用50火力維持7 min，停止加熱后自然冷卻20～30 min。用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗5 min×3次。3%過(guò)氧化氫(H2O2)孵育10 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。PBS沖洗，5 min×3次。滴加封閉液〔5%牛血清白蛋白(BSA)〕，在濕盒中室溫30 min。用濾紙擦去封閉液，勿洗。滴加適宜濃度的一抗置濕盒中4℃孵育過(guò)夜(稀釋濃度：VEGF為1∶100，NF-κB p65為1∶150，HIF-2α為1∶200)，再用PBS 5 min×3次洗去一抗，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS。滴加生物素化二抗工作液，室溫置濕盒中孵育20 min，用PBS 5 min×3次洗去二抗，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫置濕盒中孵育20 min，用PBS 5 min×3次洗去，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS。DAB顯色劑顯色，自來(lái)水充分沖洗。再進(jìn)行蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。每張組織切片在相同部位攝取3個(gè)視野(×400)。運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析，計(jì)算相同面積內(nèi)相關(guān)指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值(平均光密度值=光密度值÷測(cè)量面積)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用Shapiro-Wilk法作正態(tài)檢測(cè)，Levene法作方差檢測(cè)。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較若方差齊性采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊則采用Dunnet-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組兔膝關(guān)節(jié)滑膜IκBα、NF-κB p65、OPN蛋白表達(dá)的比較 與正常組比較，模型組兔膝關(guān)節(jié)滑膜IκBα、NF-κB p65、OPN的蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組IκBα、NF-κB p65、OPN的蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 Western印跡法檢測(cè)各組兔滑膜中IκBα、NF-κB p65、OPN蛋白表達(dá)

組別IκBα/β-actinNF-κB p65/β-actinOPN/β-actin正常組29.83±7.8140.59±5.2636.38±2.24模型組111.01±20.281)116.22±15.611)146.06±27.781)治療組77.45±18.281)2)74.97±10.711)2)92.69±7.891)2)

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；表2同

2.2各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨VEGF、HIF-2α、NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)的比較 與正常組比較，模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨VEGF、HIF-2α、NF-κB p65的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組VEGF、HIF-2α、NF-κB p65的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

圖2 各組兔軟骨VEGF、HIF-2α和NF-κB p65免疫組化陽(yáng)性表達(dá)(IHC，×100)

表2 各組兔軟骨VEGF、HIF-2α和NF-κB p65免疫組化表達(dá)結(jié)果比較

3 討 論

KOA 是一種慢性進(jìn)行性退行性疾病，病理過(guò)程包括了滑膜炎性增生、軟骨退變、骨贅形成等多個(gè)方面〔8〕。NF-κB可與多種基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子結(jié)合促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，是免疫與炎癥反應(yīng)中的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。相關(guān)研究表明，NF-κB蛋白家族存在于OA患者的多種細(xì)胞中，在滑膜組織、軟骨及軟骨下骨、關(guān)節(jié)液及周圍肌肉中均出現(xiàn)高表達(dá)〔9〕。NF-κB幾乎參與了OA發(fā)病的所有病理過(guò)程，因此通過(guò)抑制NF-κB途徑干預(yù)OA的發(fā)展，成為研究該疾病治療方法的新方向。正常情況下，胞內(nèi)NF-κB二聚體(包括p65和p50兩組蛋白)被IκB隔離在細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)NF-κB通路被上游信號(hào)介導(dǎo)的分子激活時(shí)，IκB被磷酸化導(dǎo)致蛋白酶體降解，NF-κB蛋白被釋放，介導(dǎo)信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)傳導(dǎo)。隨后，p65被磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而促進(jìn)或抑制特定基因的表達(dá)〔10，11〕。研究顯示，當(dāng)NF-κB信號(hào)通路被激活時(shí)，可以快速誘導(dǎo)表達(dá)免疫和炎癥反應(yīng)多個(gè)相關(guān)基因，其中包括細(xì)胞因子〔白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-17、環(huán)氧酶(COX)-2〕、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)形成〔12〕。IL-1β、TNF-α、IL-17是OA發(fā)病的密切相關(guān)細(xì)胞因子，除了能刺激成纖維細(xì)胞增生外，還能促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡〔13〕。MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白酶，MMPs表達(dá)增多時(shí)，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)將遭受進(jìn)行性降解而被破壞〔14〕。

OPN作為細(xì)胞免疫的早期活化因子，可激活NF-κB信號(hào)通路，參與OA的發(fā)生、發(fā)展〔15〕。有研究報(bào)道，OPN在OA重度骨贅中出現(xiàn)高表達(dá)，并且表達(dá)量與OA的X線分期嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示OPN可能在OA軟骨破壞、骨質(zhì)增生過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔16〕。敲除大鼠OPN后，其炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子的生成被抑制，作用與NF-κB抑制劑相似〔17〕。OA促使軟骨中HIF-2α的表達(dá)增加，導(dǎo)致軟骨分解和軟骨內(nèi)骨形成〔18〕。NF-κB作為HIF-2α的上游信號(hào)，與其表達(dá)水平密切相關(guān)〔19〕。實(shí)驗(yàn)表明，OA小鼠軟骨細(xì)胞中HIF-2α水平的提高將加重關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)了Epas1和Fas基因的表達(dá)及軟骨的損傷，HIF-2α的高表達(dá)還可以誘導(dǎo)軟骨骨化，導(dǎo)致關(guān)節(jié)中心的軟骨退化并在軟骨邊緣形成骨贅〔20〕。HIF-2α還可通過(guò)上調(diào)靶基因促進(jìn)VEGF的表達(dá)，加速OA的病變進(jìn)程。VEGF參與了OA血管翳的形成，血管生成過(guò)程中可促進(jìn)炎癥因子的釋放和感覺(jué)神經(jīng)的生長(zhǎng)，導(dǎo)致OA關(guān)節(jié)疼痛和腫脹加重〔21〕。Ludin等〔22〕用VEGF注射液在正常小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，每周1次，數(shù)周后該關(guān)節(jié)出現(xiàn)骨贅形成，說(shuō)明VEGF與OA骨贅形成相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，模型組兔膝關(guān)節(jié)滑膜中IκBα、NF-κB p65、OPN的蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，軟骨中VEGF、HIF-2α、NF-κB p65的表達(dá)明顯升高，說(shuō)明木瓜蛋白酶膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)OA模型建立。與模型組比較，治療組關(guān)節(jié)滑膜中IκBα、NF-κB p65、OPN的蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，關(guān)節(jié)軟骨中VEGF、HIF-2α、NF-κB的表達(dá)明顯降低，說(shuō)明鹿角壯骨膠囊可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活發(fā)揮對(duì)OA的保護(hù)作用。

綜上所述，鹿角壯骨膠囊可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活而發(fā)揮緩解KOA的作用。KOA的發(fā)病是多種炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)的結(jié)果，而NF-κB信號(hào)通路是其中的主要通路之一。鹿角壯骨膠囊還可能存在多通路相互作用，尚待進(jìn)一步研究了解。