戈立秀 趙凱 高巧營 宗春輝 常艷敏

(天津市南開醫(yī)院 1檢驗科，天津 300100;2心內一科;3天津市中西醫(yī)結合急腹癥研究所)

對比劑腎病(CIN)是指使用對比劑24～72 h后發(fā)生的無其他原因可解釋的急性腎損傷，是應用對比劑后最常見的并發(fā)癥。當患者伴有糖尿病、慢性腎臟病或高血壓等基礎疾病時，使用高滲對比劑可使CIN發(fā)生率高達25%〔1，2〕。有研究顯示對比劑可直接損傷腎小管，誘導腎臟細胞凋亡，加劇腎損傷〔3〕。蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/P70核糖體蛋白S6激酶(P70S6K)信號通路是一條經(jīng)典的抗凋亡通路，既往研究發(fā)現(xiàn)對比劑可下調磷酸化Akt/mTOR水平〔4，5〕，而PI3K/Akt通路又可調節(jié)叉頭狀轉錄因子(Fox)O1磷酸化水平。FoxO1是FoxO亞家族中的一員，在抗氧化應激、調節(jié)糖脂代謝、轉錄翻譯及調控細胞周期等方面發(fā)揮重要的作用〔6〕。提示Akt/mTOR/P70S6K信號通路可影響FoxO1水平，促進腎細胞凋亡，這為糖尿病患者CIN的機制研究提供了新方向。

冬蟲夏草是一種名貴蟲草屬植物類藥用真菌，具有改善氧化應激狀態(tài)、減少促炎因子釋放、調節(jié)微循環(huán)、減輕腎損傷等功效，并通過保護和調節(jié)腎組織表皮生長因子，促進腎小管修復和再生，保護腎臟〔7〕。目前關于冬蟲夏草預防CIN的分子學機制研究較少，本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)〔3，8，9〕，糖尿病患者給予普羅布考干預后行介入診療時CIN的發(fā)生率明顯降低，并且腎功能及腎損傷等指標都有明顯改善。因此，本文以普羅布考為陽性對照藥，探討FoxO1在冬蟲夏草預防糖尿病模型大鼠CIN中的分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康SD大鼠80只，體重240～260 g，購自軍事醫(yī)學科學院環(huán)境所動物中心。

1.2試劑、儀器 鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)；冬蟲夏草原粉(杭州中美華東制藥有限公司惠贈)；碘克沙醇注射液(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)；血清尿素氮(BUN)及肌酐(Scr)試劑盒(南京建成科技有限公司)；尿中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)和白細胞介素(IL)-18(上海藍基生物有限公司)；腎損傷因子(KIM)-1檢測(美國R&D公司)；兔抗小鼠FoxO1單克隆抗體、兔抗小鼠磷酸化(p)-FoxO1(ser256)多克隆抗體，美國 Epitomics 公司；p-Akt(Ser473)抗體、p-mTOR(Ser2448)抗體、p-P70S6K、β-actin(Cell Signaling公司)；動物組織RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR(北京天根生化科技有限公司)。蛋白核酸測定儀(Eppendorf AG公司)；Western印跡電泳設備、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；Q5型熒光定量PCR儀、垂直電泳及轉印槽(美國Bio-rad公司)；病理包埋機、切片機(LEICA公司)；LEICA DM4000B正置顯微鏡(德國LEICA公司)。

1.3糖尿病大鼠模型建立及分組 實驗開始前SD大鼠適應性喂養(yǎng)1 w，造模前檢測尾靜脈血糖，均在正常范圍。隨機選取20只大鼠為正常對照組(N組)，其余60只大鼠腹腔單劑量注射鏈脲佐菌素60 mg/kg建立糖尿病模型，注射后72 h及7 d后斷鼠尾測血糖，以非禁食血糖≥16.7 mmol/L判定糖尿病大鼠模型成功，將成功建模的糖尿病模型大鼠隨機分為對比劑腎病組(M組)、冬蟲夏草組(D組)、普羅布考組(P組)，每組20只。

1.4CIN模型建立 根據(jù)CIN造模及用藥方法〔10〕，SD大鼠飼養(yǎng)10 w后，D組給予冬蟲夏草3.0 g/kg灌胃，P組給予普羅布考500 mg/kg灌胃，N組、M組以等量生理鹽水灌胃，連續(xù)6 d，第7天禁水不禁食。7 d后，麻醉狀態(tài)下，除N組外其他三組動物經(jīng)尾靜脈注射對比劑碘克沙醇320(2.0 g/kg)，注射時間為5 min，然后給予自然飲水。以注射對比劑24 h后Scr比N組升高(>25%)判定CIN的模型是否成功。

1.5實驗取材 注射對比劑后24 h，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，開腹取下腔靜脈血2 ml，迅速取下雙腎。左腎剖開部分固定于甲醛，以備腎臟病理研究；右腎-80℃凍存，用于檢測氧化應激指標。

1.6腎功能及損傷指標檢測 脲酶法測定血清BUN；苦味酸法測定血清Scr；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測NGAL、腎KIM-1、IL-18。

1.7腎組織勻漿氧化應激指標檢測 硝酸還原酶法檢測一氧化氮(NO)，氧化還原法測定一氧化氮合酶(NOS)，黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶(SOD)，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)，比色法測定總抗氧化能力(T-AOC)。

1.8Akt/mTOR/P70S6K與FoxO1的mRNA含量檢測 Trizol法提取腎臟組織總RNA，引物均由上海生工生物技術有限公司合成，見表1，逆轉錄產物通過IQ5型熒光定量PCR儀進行定量檢測。參照 2-ΔΔCt法〔11〕進行結果分析。

表1 各基因引物序列

1.9Western印跡 提取腎組織總蛋白，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉、抗原抗體反應、放射自顯影，檢測腎組織p-Akt/p-mTOR/p-P70S6K及FoxO1、p-FoxO1蛋白表達量。

1.10病理學形態(tài)檢測 腎組織常規(guī)脫水石蠟包埋，切片后進行梯度酒精脫水、透明、HE染色，于正置顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化。

1.11統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組造影24 h后腎功能、腎損傷指標變化情況 與N組比較，M組BUN、Scr、NAGL、KIM-1、IL-18含量明顯升高(P<0.05)；D組BUN、Scr明顯升高，NGAL、KIM-1、IL-18明顯降低；P組BUN、Scr、NGAL明顯升高，IL-18明顯降低(均P<0.05)，KIM-1無明顯變化。與M組比較，P組BUN、Scr、NAGL、IL-18含量明顯降低(P<0.05)，而KIM-1無明顯變化(P>0.05)；D組BUN、Scr、NAGL、KIM-1、IL-18含量明顯降低(P<0.05)。與P組比較，D組Scr、BUN、NAGL、KIM-1、IL-18含量明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.2腎組織勻漿氧化應激指標的檢測 與N組比較，M組NO、NOS、MDA含量明顯升高，SOD、T-AOC含量明顯下降(P<0.05)。與M組比較，D組MDA含量明顯降低，NO、NOS、SOD和T-AOC含量明顯升高；P組MDA含量明顯降低，NO、NOS和SOD含量明顯升高(P<0.05)，T-AOC無明顯變化(P>0.05)。與P組比較，D組T-AOC含量明顯升高(P<0.05)，其余無明顯變化(P>0.05)。見表3。

表2 給予藥物干預后大鼠腎臟功能各指標的變化情況

與N組比較:1)P<0.05；與M組比較:2)P<0.05；與P組比較:3)P<0.05；下表同

表3 給予藥物干預后大鼠腎臟NO、NOS、MDA、SOD、T-AOC的變化

2.3各組腎臟FoxO1表達 與N組相比，M組FoxO1 mRNA 和蛋白表達無明顯差異，D組、P組FoxO1 mRNA和蛋白表達均明顯升高(P<0.05)。與N組相比，M組p-FoxO1 蛋白表達升高；與M組相比，D組和P組p-FOXO1蛋白表達顯著降低，p-FoxO1/FoxO1 比值顯著降低。見圖1。

2.4Akt/mTOR/P70S6K信號通路mRNA和蛋白表達變化 與N組相比，M組p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K mRNA和蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)；D組和P組p-Akt、p-mTOR mRNA水平雖明顯下降(P<0.05)，但蛋白表達水平卻明顯升高(P<0.05)，D組、P組p-P70S6K mRNA與N組相比分別表現(xiàn)為無明顯差異和明顯下降，蛋白表達水平均表現(xiàn)為明顯升高。與M組相比，D組和P組p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K mRNA和蛋白表達水平均明顯升高。見圖2，表4。

圖1 Western印跡檢測FoxO1和p-FoxO1蛋白表達

2.5HE染色檢測腎小球、腎小管損傷程度 N組腎小球、腎小管上皮細胞結構完整，未見明顯損傷；M組腎小球基底膜增厚，近曲小管腫脹，胞質嗜酸性、細顆粒狀，結構不清，遠曲小管萎縮，胞質透明變性。P組和D組的腎小球基底膜無明顯增厚，近曲小管輕度嗜酸性變，結構清晰。見圖3。

圖2 Western印跡檢測磷酸化Akt/mTOR/P70S6K信號通路蛋白表達

表4 給予藥物干預后大鼠腎臟Akt/mTOR/P70S6K及FoxO1 mRNA的變化

圖3 各組腎組織病理改變(HE，×200)

3 討 論

目前認為CIN是院內獲得的急性腎損傷的重要原因之一，其中糖尿病被認為是CIN發(fā)生的獨立危險因素〔12〕。CIN的發(fā)病機制尚不完全清楚，有研究報道冬蟲夏草及普羅布考均可對藥物所致急性腎損傷動物模型具有保護作用，可促進腎小管修復，改善腎功能〔13，14〕。本研究結果顯示，與糖尿病CIN大鼠模型相比，給予冬蟲夏草后腎功能指標BUN、Scr及腎損傷指標NGAL、KIM-1、IL-18均明顯降低;給予普羅布考后，上述指標除KIM-1外，其他都有所下降。以上結果表明冬蟲夏草能夠改善糖尿病CIN大鼠的腎功能，減輕腎損傷。氧化應激在 CIN 發(fā)病中起重要作用，這與活性氧的產生密切相關〔15〕。對比劑可通過多種途徑誘導腎臟活性氧合成增多，首先對比劑可損傷腎小管細胞基底膜及系膜細胞，增強中性粒細胞的趨化作用，使活性氧產生增加；其次對比劑可增強腎臟黃嘌呤氧化酶的活性，降低SOD活性，增加腎活性氧合成。研究顯示〔16〕，大鼠腎臟被部分切除后，腎皮質及線粒體中MDA含量明顯增加，給予冬蟲夏草治療后，MDA表達下降，SOD表達增加，大鼠腎組織抗氧化能力增強。根據(jù)以上研究，本文檢測了一系列氧化應激指標。NO化學性質活潑、易擴散，適量應用可改善微循環(huán)，減輕腎缺血。NO主要由限速酶NOS催化而成。SOD作為防御內外環(huán)境中超氧離子損傷的重要酶，可特異性清除氧自由基，是反映腎臟及機體氧化應激狀態(tài)的重要指標。MDA是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化時產生的一種最終代謝產物。本研究結果顯示，冬蟲夏草可使腎組織中NO含量增加，改善了腎臟微循環(huán)，同時抑制脂質過氧化反應，增強自由基清除及抗氧化應激，減輕腎缺血缺氧及腎小管凋亡，達到改善腎功能的效果。

FoxO1是Forkhead 轉錄因子的一個亞家族，是一類重要的氧化還原敏感的轉錄因子，參與細胞周期調控、凋亡、氧化應激等生物學過程〔17〕，廖鑫等〔18〕發(fā)現(xiàn)FoxO1的表達與血糖血脂密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)，具有明顯抗氧化應激作用的冬蟲夏草組可使FoxO1 mRNA 水平和蛋白表達升高，說明FoxO1可通過減少氧化應激物質的過度釋放而改善腎臟抗氧化應激的能力。也有研究發(fā)現(xiàn)FoxO1 可做為Akt信號通路的重要中樞位點〔19〕。Akt/mTOR信號通路是一條經(jīng)典的抗凋亡通路，Akt 磷酸化可激活mTOR，活化的mTOR在激活內皮細胞的過程中發(fā)揮重要作用〔20〕，并能抑制細胞凋亡〔4，21〕。P70S6K是mTOR的主要下游作用靶物〔22〕，其本身并不具有生物活性，經(jīng)磷酸化激活后，蛋白質結構發(fā)生變化并和其他蛋白質相互作用而形成多蛋白復合物。本研究結果顯示，造影劑阻止了Akt/mTOR/P70S6K信號通路的表達，給予冬蟲夏草和普羅布考后p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K mRNA水平雖然有不同程度的降低或無改變，但相應的蛋白水平卻都表現(xiàn)為升高；冬蟲夏草和普羅布考可上調Akt/mTOR/P70S6K mRNA和蛋白表達水平，當藥物給予信號通路上游一定刺激后，Akt/mTOR/P70S6K被磷酸化激活，活化的信號進入核內激活其下游的FoxO1，F(xiàn)oxO1 mRNA和蛋白表達均升高，而p-FoxO1表達顯著降低，p-FoxO1易失去轉錄活性。故認為冬蟲夏草可通過上調Akt/mTOR/P70S6K mRNA和蛋白表達水平，進而促進FoxO1表達升高。

本研究探討FoxO1在冬蟲夏草預防糖尿病CIN大鼠模型中的作用，通過調節(jié)上游信號Akt/mTOR/P70S6K通路及靶轉錄因子 FoxO1重新整合凋亡信息，其機制可能是減輕了氧化應激和腎細胞凋亡。本文進一步探討了冬蟲夏草對糖尿病 CIN 的腎臟保護作用及其對凋亡信號通路的影響，為中醫(yī)藥防治 CIN提供新的理論基礎和實驗證據(jù)。