朱麗娟 張振山 夏楠楠 張偉峰 鄭晶 孟飛龍 楊磊 沈龍

(1鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河南 鄭州 450007；2中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院風(fēng)濕免疫科；3廈門大學(xué))

原發(fā)性干燥綜合征(PSS)是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，臨床癥狀復(fù)雜多樣，病理表現(xiàn)主要可見大量淋巴細(xì)胞浸潤外分泌腺及內(nèi)臟器官。PSS在我國發(fā)病率為0.3%～0.7%，多發(fā)于30～40歲或絕經(jīng)女性，其發(fā)病機制至今尚不明確〔1〕。PSS在老年人群中致病高達(dá)0.77%，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量〔2〕。微小RNA(miRNA)是一類長度為18～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過與其靶基因3'非翻譯區(qū)(UTR)區(qū)序列結(jié)合形成沉默復(fù)合物，通過降解其靶基因或抑制其靶基因翻譯，參與調(diào)節(jié)機體生長、發(fā)育、細(xì)胞衰老、凋亡等多種生物過程〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可調(diào)節(jié)機體免疫功能、維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定，在固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用〔4〕。本研究擬觀察miR-146a和miR-155在老年P(guān)SS患者血清中表達(dá)。

1 資料與方法

1.1一般資料 2016年1月至2019年1月鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院收集的80例首次確診的PSS患者為疾病組，其中男5例，女75例，年齡55～84〔平均(68.32±12.41)〕歲。另選取同期體檢正常者80例為對照組，其中男4例，女76例，年齡55～85〔平均(69.15±13.25)〕歲。兩組在年齡和性別構(gòu)成上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，樣品采集均取得患者及家屬知情同意，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2納入排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照2012年美國《風(fēng)濕病學(xué)協(xié)會干燥綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)》〔5〕，首次診斷為PSS；②年齡≥50歲；③未進(jìn)行激素、免疫抑制劑治療；④自愿接受治療研究，并能完成臨床記錄；排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重感染性疾病；②精神異常；③有嚴(yán)重臟器功能障礙或其他惡性腫瘤；④有糖尿病、高血壓等疾病。

1.3主要試劑與儀器 Trizol試劑(編號：R0016)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PrimeScriptTMRT試劑盒(Perfect Real Time，編號RR037A)、PrimeScriptTMⅡ第一鏈cDNA合成試劑盒(編號：6210A)購自北京TaKaRa；引物由上海生工生物公司合成，miR-146a引物：上游5'-AGAACTGAATTCCATGGGTT-3',下游:5'-GACAGAGATATCCCAGCTGAAGAA-3';miR-155引物：上游5'-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT-3',下游:5'-CCTTAAAACTCCACTAGAAGCA-3';U6引物：上游5'-ATTGGA-ACGATACAGAGAAGATT-3'，下游:5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。MODEL550型酶標(biāo)儀、實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀美國Bio-Rad公司、邁瑞5380生化儀、美國Beckman IMMAGE800生化儀等。

1.4樣品采集及保存 采集PSS患者和對照組血液5 ml，于1 h內(nèi)3 000 r/min室溫離心5 min分離血清，凍存于-80℃冰箱備用。

1.5qRT-PCR檢測血清中miR-146a、miR-155表達(dá)水平 采用Trizol試劑提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用定量PCR儀(Bio-Rad)對miR-146a和miR-155進(jìn)行擴增。qRT-PCR反應(yīng)采用20 μl體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μl，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)0.4 μl，cDNA(50 ng/ μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ddH2O 6.0 μl。反應(yīng)采用兩步法，條件設(shè)置為：95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 34 s，40個循環(huán)；添加溶解曲線。采用2-ΔΔCT法對血清miR-146a和miR-155表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.6血清指標(biāo)檢測 采用阻抗法檢測血清白細(xì)胞(WBC)含量，采用免疫比濁法測定血清免疫球蛋白(Ig)G抗體水平，采用間接免疫熒光法檢測血清抗核抗體(ANA)，采用免疫組化法檢測血清抗SSA、抗SSB抗體。根據(jù)檢測結(jié)果將疾病組分為抗ANA陽性(+)53例，抗ANA陰性(-)27例；抗SSA陽性(+)56例，抗SSA陰性(-)24例；抗SSB陽性(+)52例，抗SSB陰性(-)28例。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行χ2檢驗、t檢驗、Pearson相關(guān)系數(shù)分析、受試者工作特征(ROC)曲線分析。

2 結(jié) 果

2.1對照組與疾病組血清miR-146a、miR-155表達(dá)比較 與對照組比較，疾病組血清miR-146a表達(dá)水平顯著升高(1.02±0.35 vs 3.28±0.71,t=25.536,P<0.001)，miR-155表達(dá)水平顯著降低(1.13±0.27 vs 0.56±0.12,t=17.255,P<0.001)。

2.2對照組與疾病組WBC、血清IgG水平比較 與對照組比較，疾病組患者WBC數(shù)顯著減少〔(7.95±2.61)×109/L vs(3.52±1.47)×109/L,t=13.228,P<0.001〕，血清中IgG水平顯著增加〔(9.72±3.51)g/L vs (20.61±5.47)g/L,t=14.987,P<0.001〕。

2.3血清miR-146a、miR-155表達(dá)水平與PSS患者炎性損傷指標(biāo)的關(guān)系 與抗ANA(-)組比較，抗ANA(+)組miR-146a表達(dá)水平顯著升高，miR-155表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)；與抗SSA(-)組比較，抗SSA(+)組miR-146a表達(dá)水平顯著升高，miR-155表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)；與抗SSB(-)組比較，抗SSB(+)組miR-146a表達(dá)水平顯著升高，miR-155表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)。見表1。

表1 疾病組血清miR-146a、miR-155表達(dá)水平與炎癥損傷指標(biāo)間關(guān)系

2.4PSS患者血清miR-146a、miR-155表達(dá)水平的相關(guān)性 PSS患者血清中miR-146a與miR-155表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.718，P<0.05)。見圖1。

圖1 PSS患者血清miR-146a、miR-155表達(dá)水平的相關(guān)性

2.5PSS患者血清中miR-146a、miR-155與WBC、IgG水平的相關(guān)性 PSS患者血清中miR-146a與WBC呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.694，P<0.05)，與IgG呈顯著正相關(guān)(r=0.690，P<0.05)；miR-155與WBC呈顯著正相關(guān)(r=0.566，P<0.05)，與IgG呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.693，P<0.05)。見圖2，圖3。

2.6血清miR-146a、miR-155表達(dá)水平對PSS的診斷價值 分別以血清miR-146a、miR-155表達(dá)水平及二者聯(lián)合預(yù)測值為檢驗變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，血清miR-146a、miR-155表達(dá)水平診斷PSS的曲線下面積(AUC)為0.831、0.834，截斷值為0.625、0.651，特異度為0.825、0.838，靈敏度為0.800、0.813；二者聯(lián)合診斷PSS的AUC為0.884，截斷值為0.688，特異度為0.925，靈敏度為0.763。見圖4。

圖2 PSS患者血清中miR-146a與WBC水平及IgG水平的相關(guān)性

圖3 PSS患者血清中miR-155與WBC水平及IgG水平的相關(guān)性

圖4 血清miR-146a、miR-155對PSS疾病的ROC曲線

3 討 論

PSS屬自身免疫性疾病范疇，臨床典型表現(xiàn)為口、眼干燥，并可累及全身多種器官。該病好發(fā)于女性，尤其絕經(jīng)后女性，嚴(yán)重威脅老年女性群體健康。目前臨床唇腺活檢及腮腺造影診斷PSS的特異性較高，但有創(chuàng)檢測醫(yī)療費用高，在推廣應(yīng)用中受限〔6〕。因此尋找PSS敏感且特異的早期診斷指標(biāo)對早發(fā)現(xiàn)、早治療、有效控制病情發(fā)展意義重大。

近來研究表明，miRNA進(jìn)化過程中高度保守，廣泛存在于線蟲、細(xì)菌、病毒、植物及哺乳動物中，參與生物體的生長、發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡等多種生命活動〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs表達(dá)和功能失調(diào)與多種疾病，如癌癥〔8〕、腫瘤〔9〕及許多自身免疫性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎〔10〕、干燥綜合征〔11〕等發(fā)生有關(guān)。miR-146a是一種與慢性炎性疾病有關(guān)的miRNA，在天然免疫和獲得性免疫中有重要調(diào)控作用〔12〕。miR-155位于人類21號染色體上，是一個多功能miRNA，在淋巴細(xì)胞應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，還可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、呈遞抗原、調(diào)控免疫過程中細(xì)胞因子生成等〔13〕。

Sun等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a表達(dá)與PSS發(fā)生有關(guān)，可作為診斷PSS發(fā)生的生物標(biāo)志。王笑顏等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a-5p在PSS患者中表達(dá)上調(diào)。陳慕芝等〔15〕研究表明，miR-155在PSS患者外周血單個核細(xì)胞中顯著低表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-146a在PSS患者血清中顯著高表達(dá)，miR-155顯著低表達(dá)，提示血清miR-146a、miR-155表達(dá)可能與PSS有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，抗SSA抗體可能與PSS患者血液系統(tǒng)障礙尤其WBC減少密切相關(guān)〔6〕。van Woerkom等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)PSS患者血清中IgG升高，且可作為判斷PSS活動指標(biāo)。本研究提示PSS發(fā)生伴隨WBC減少，IgG抗體數(shù)增加。進(jìn)一步分析提示miR-146a、miR-155可能與PSS發(fā)展及炎性損傷過程有關(guān)。研究表明，抗ANA、抗SSA、抗SSB是非特異性抗體，當(dāng)自身免疫反應(yīng)發(fā)生時，這些抗體水平會隨免疫反應(yīng)嚴(yán)重程度升高，其中抗SSA抗體常見于PSS和系統(tǒng)性紅斑狼瘡女性患者，抗SSB抗體幾乎僅見于PSS患者，抗ANA、抗SSA、抗SSB抗體水平常作為臨床診斷PSS實驗室檢測指標(biāo)〔6〕，結(jié)合本研究結(jié)果提示miR-146a、miR-155水平變化可能與PSS患者炎癥損傷程度有關(guān)。本研究提示而miR-16a、miR-155可能共同參與PSS疾病發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步采用ROC曲線分析血清miR-146a、miR-155水平對PSS診斷價值提示聯(lián)合檢測血清miR-146a、miR-155水平對PSS疾病診斷的AUC顯著增加，對PSS疾病診斷有一定參考價值，但本研究納入樣本量較少，其具體可行性有待深入探究。

綜上，PSS患者血清中miR-146a高表達(dá)，miR-155低表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)，可能作為診斷PSS疾病的潛在生物標(biāo)志。