胡凌波 周仁杰

(浙江省臺州醫(yī)院肝膽胰外科，浙江 臺州 317000)

原發(fā)性肝癌和病毒性肝炎、肝硬化關(guān)系密切，是肝細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤；原發(fā)性肝癌的病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分明確〔1〕。原發(fā)性感染的發(fā)病率和死亡率比較高，對人類健康造成嚴(yán)重危害。原發(fā)性肝癌早期癥狀不明顯，不少患者被確診時(shí)已為原發(fā)性肝癌中晚期，錯(cuò)過了治療的最佳時(shí)間，即使可以得到根治性的治療，5年內(nèi)復(fù)發(fā)率仍比較高〔2〕。原發(fā)性肝癌病情發(fā)展可導(dǎo)致肝衰竭，晚期癌細(xì)胞增殖，向周圍組織及遠(yuǎn)處器官擴(kuò)散，惡化程度增加〔3〕。因此早診斷早治療可有效提高原發(fā)性肝癌的預(yù)后。miRNAs為非編碼小分子RNA，具有調(diào)控基因表達(dá)，可干擾轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而對靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔4,5〕。本文對原發(fā)性肝癌血清miR-6861-5p水平進(jìn)行研究，探討其與原發(fā)性肝癌臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系及其在診斷和預(yù)后預(yù)測中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇浙江省臺州醫(yī)院2010年1月至2013年12月原發(fā)性肝癌患者80例作為原發(fā)性肝癌組和健康體檢者80例作為對照組。原發(fā)性肝癌組年齡(61.24±12.41)歲，男52例，女28例；腫瘤直徑≥5 cm者43例，<5 cm者37例；TNM分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期19例，Ⅲ22例，Ⅳ期14例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移11例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移69例。對照組年齡(60.89±11.53)歲，男47例，女33例。原發(fā)性肝癌組和對照組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性肝癌患者均為首診、進(jìn)行手術(shù)治療的患者，且經(jīng)病理證實(shí)為原發(fā)性肝癌，手術(shù)前未進(jìn)行放化療及其他相關(guān)治療，所有研究對象簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：重要臟器功能不全者，合并其他惡性腫瘤者，圍術(shù)期死亡者，臨床資料及隨訪資料不全者，術(shù)后無法接受隨訪及中途退出者。

1.2研究方法 血清miR-6861-5p水平測定：抽取原發(fā)性肝癌組和對照組患者外周血5 ml，采用miRNA提取試劑盒(購自HaiGene公司)提取總miRNA，對提取的miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自HaiGene公司)，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定血清miR-6861-5p水平(儀器及試劑盒購自購自HaiGene公司)，PCR條件為95℃ 10 min，95℃ 30 s，55℃ 20 s，共42個(gè)循環(huán)，然后60℃ 1 min。以U6為內(nèi)參照。miR-6861-5p上游引物為：5'-ACAC TCCA GCTG GGAC TGGG TAGG TGGG C-3'，下游引物為：5'-GTGC AGGG TCCG AGGT-3'。血清miR-6861-5p水平以2-ΔΔCT表示。

1.3隨訪 原發(fā)性肝癌患者術(shù)后采用電話或門診隨訪，隨訪時(shí)間從患者手術(shù)時(shí)間開始至隨訪截止時(shí)間或術(shù)后死亡時(shí)間，隨訪截止時(shí)間為2017年12月31日。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，血清miR-6861-5p水平對原發(fā)性肝癌的診斷價(jià)值采用受試者工作特征(ROC)曲線下面積分析，生存曲線采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)分析。

2 結(jié) 果

2.1原發(fā)性肝癌組和對照組血清miR-6861-5p水平比較 原發(fā)性肝癌組血清miR-6861-5p水平明顯高于對照組(1.87±0.21 vs 1.00±0.06，t=35.629,P=0.000)。

2.2血清miR-6861-5p水平與原發(fā)性肝癌臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系 血清miR-6861-5p水平與原發(fā)性肝癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者血清miR-6861-5p水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；血清miR-6861-5p水平與年齡、性別、腫瘤直徑無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 血清miR-6861-5p水平與原發(fā)性肝癌臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系

2.3血清miR-6861-5p水平對原發(fā)性肝癌的診斷價(jià)值 ROC曲線顯示：血清miR-6861-5p以1.35為診斷閾值，診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線下面積為0.863(95%CI：0.860～0.866)，診斷敏感度為75%，診斷特異度為87%。見圖1。

2.4血清miR-6861-5p與原發(fā)性肝癌生存期的關(guān)系 以ROC曲線中血清miR-6861-5p的中位數(shù)值為界，高表達(dá)患者的無病生存期為(23.41±14.57)個(gè)月，總生存期為(34.82±10.48)個(gè)月；低表達(dá)患者的無病生存期為(32.15±15.36)個(gè)月，總生存期為(42.57±11.06)個(gè)月。miR-6861-5p低表達(dá)患者的無病生存期和總生存期均明顯高于高表達(dá)患者(P=0.011、0.015)。見圖2和圖3。

圖1 血清miR-6861-5p診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線

圖2 血清miR-6861-5p與原發(fā)性肝癌無病生存期的關(guān)系

圖3 血清miR-6861-5p與原發(fā)性肝癌總生存期的關(guān)系

3 討 論

原發(fā)性肝癌是惡性腫瘤相關(guān)性死亡的原因之一，隨著醫(yī)學(xué)水平的發(fā)展，原發(fā)性肝癌的早期診斷取得了一定進(jìn)步，但由于原發(fā)性肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和侵襲的存在，預(yù)后仍比較差，且原發(fā)性肝癌的復(fù)發(fā)率高、容易轉(zhuǎn)移，使原發(fā)性肝癌的總生存期不是太理想〔6,7〕。因此尋找原發(fā)性肝癌的生物標(biāo)志物在原發(fā)性肝癌的診斷、治療及預(yù)后預(yù)測中具有重要價(jià)值。

miRNA長度為20～25個(gè)核苷酸，為一類內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA，在真核細(xì)胞生物中廣泛存在〔8〕。人類miRNA在人類基因組中的比例比較小，約占1%，其中大約50%定位于染色體脆弱區(qū)，染色體脆弱區(qū)和人類癌癥的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切〔9〕。miRNA在細(xì)胞核中經(jīng)過RNA聚合酶催化可轉(zhuǎn)錄成初級miRNA，初級miRNA長度約數(shù)千核苷酸，隨后被RNA酶識別并切割成前體miRNA，前體miRNA具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5的作用下，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，被另一種RNA酶剪切成miRNA-miRNA二聚體，該二聚體結(jié)合Argonaute蛋白，激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白，然后被切割成兩條miRNA單鏈，其中一條單鏈游離出復(fù)合體，很快被降解，而另一條單鏈為成熟的miRNA，在RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體形成中發(fā)揮重要作用；當(dāng)miRNA完全綁定目標(biāo)信使RNA時(shí)刻造成mRNA降解；當(dāng)miRNA不完全綁定時(shí)可阻遏其轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮基因沉默作用〔10〕。不同的miRNA對細(xì)胞的調(diào)控作用不同，在原發(fā)性肝癌中存在多種miRNA異常，參與原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展過程〔11,12〕。

miRNA在外周血中有豐富的穩(wěn)定表達(dá)，由于miRNA內(nèi)源性結(jié)構(gòu)特性決定了血清miRNA具有抗核糖核酸酶的能力，血清中miRNA即使經(jīng)過pH值改變、反復(fù)凍融等仍可以維持穩(wěn)定〔13〕。血清miRNA的穩(wěn)定性使其被認(rèn)為是最具潛力的惡性腫瘤生物標(biāo)志物〔14〕。在原發(fā)性肝癌患者血清中存在多種miRNA水平異常，多種血清miRNA被證實(shí)在原發(fā)性肝癌的診斷、治療及預(yù)后預(yù)測中具有重要價(jià)值，為原發(fā)性肝癌的潛在腫瘤標(biāo)志物〔15,16〕。

miR-6861-5p定位在人染色體12q24.13上，關(guān)于miR-6861-5p功能的研究不多，袁超〔17〕研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清miR-6861-5p水平升高，是乳腺癌術(shù)前診斷、臨床分期、細(xì)胞轉(zhuǎn)移和術(shù)后檢測復(fù)發(fā)的潛在生物標(biāo)記物；Shimomura等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清miR-6861-5p水平高于健康女性，且血清miR-6861-5p與血清miR-1307-3p、miR-1246、miR-4634、miR-6875-5p聯(lián)合診斷乳腺癌的靈敏度為97.3%，特異度為82.9%；付紅偉等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清miR-6861-5p水平升高，miR-6861-5p聯(lián)合CA153對乳腺癌具有比較高的診斷效能，可作為乳腺癌診斷的一種有效手段。本研究結(jié)果表明隨著原發(fā)性肝癌病情嚴(yán)重程度加重，血清miR-6861-5p水平升高，血清miR-6861-5p水平在判斷原發(fā)性肝癌病情嚴(yán)重程度和預(yù)后預(yù)測中也具有重要價(jià)值。