羅勁松 何淼

(1德陽市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 德陽 618000；2德陽市人民醫(yī)院腫瘤科)

原發(fā)性肝癌是指發(fā)生于肝細胞或肝內(nèi)膽管上皮細胞的惡性腫瘤，是臨床上最為常見的惡性腫瘤疾病之一，亦是全球范圍內(nèi)死亡率最高的一種惡性腫瘤，具有惡性程度高、侵襲性強等特點，患者預(yù)后較差〔1〕。有研究報道顯示〔2〕，由于肝癌發(fā)病較為隱匿，患者早期臨床癥狀不明顯，大部分患者確診時已屬中晚期，喪失了手術(shù)根治的最佳時機。96序列相似的家庭成員(FAM96)A是一種廣泛存在于機體中的高度保守的凋亡激活蛋白，是細胞有絲分裂中的重要蛋白。FAM96A具有調(diào)節(jié)細胞增殖、促進細胞凋亡的作用，但目前FAM96A與肝癌的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系亦存在未知〔3〕。本研究旨在探討肝癌組織中FAM96A的表達及與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 2014年2月至2016年2月德陽市第二人民醫(yī)院收治的肝癌患者112例。納入標準〔4〕：①患者均經(jīng)臨床檢查、影像學(xué)檢查及手術(shù)病理檢查確診為肝癌；②不存在過敏體質(zhì)；③年齡>20歲；④臨床病歷資料完整；⑤患者入院前均未接受相關(guān)抗腫瘤治療；⑥均接受腹腔鏡肝癌根治術(shù)治療。排除標準：①合并其他惡性腫瘤者；②繼發(fā)性肝癌或肝膿腫血管瘤者；③存在神經(jīng)系統(tǒng)疾病或交流溝通障礙者；④伴有心、肝、腎等臟器功能嚴重障礙者；⑤正參與其他研究者。其中男68例，女44例，年齡32～72歲，平均(48.32±10.52)歲；腫瘤直徑3.5～9.2 cm，平均(5.12±0.53)cm；病灶數(shù)目：單發(fā)病灶72例，多發(fā)病灶40例；有門靜脈癌栓30例，無門靜脈癌栓82例；肝外轉(zhuǎn)移：陽性18例，陰性94例；Child分級：A級92例，B級20例；臨床TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期54例，Ⅲ～Ⅳ期58例?；颊呒凹覍俸炇鹆酥橥鈺?，本研究經(jīng)德陽市第二人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2研究方法 分別采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)與Western印跡法檢測肝癌組織與癌旁組織中FAM96A的mRNA及蛋白表達情況。(1)實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)：提取肝癌組織與癌旁組織的細胞總mRNA，嚴格根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，并將其保存于-20℃冰箱中備用，其與RNA則保存于-80℃冰箱中備用。其中實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)體系如下：SYBR Green 10 μl，cDNA 2 μl，上、下游引物(濃度10 μmol/L)各0.6 μl，將以上底物加入焦炭酸二乙酯水至20 μl。反應(yīng)條件為變性、退火和延伸，共計35個循環(huán)。其中引物序列如下：上游引物：5′-GCAAAGCACGCTGGAACT-3′，下游引物：5′-GGCCGAGACAAGCGTAAA-3′。其中RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)率試劑盒均購自武漢博士德有限公司，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒均購自大連寶生物有限公司。(2)Western印跡：分別取肝癌組織、癌旁組織各0.08 g，進行組織研磨，加入細胞裂解液，按照試劑盒操作說明提取總蛋白。制備5%的濃縮膠與15%的分離膠，計算上樣量和上樣緩沖液用量，然后加入電泳液后進行上樣，電泳條件為：濃縮膠80 V，分離膠100 V，150 min。聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)移蛋白，轉(zhuǎn)模90 min，脫脂奶粉封閉，加入生物學(xué)一抗，標記二抗，過夜后洗膜，以電化學(xué)發(fā)光法顯影。一抗、二抗均購自英國Abcam公司，電化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Invitrogen公司。(3)對患者均進行為期2年的隨訪，分析其復(fù)發(fā)情況。(4)將FAM96A蛋白相對表達量<0.500記為FAM96A蛋白低表達組，將FAM96A蛋白相對表達量≥0.500記為FAM96A蛋白高表達組。

1.3觀察指標 比較肝癌組織與癌旁組織中FAM96A的mRNA及蛋白表達情況。分析肝癌組織中FAM96A蛋白表達情況與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進行χ2、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1肝癌組織與癌旁組織中FAM96A的mRNA及蛋白相對表達量情況對比 肝癌組織中FAM96A的mRNA及蛋白相對表達量均顯著低于癌旁組織(均P<0.05)。見表1。

2.2肝癌組織中FAM96A的蛋白相對表達量與臨床病理特征的關(guān)系分析 腫瘤直徑<5 cm、無門靜脈癌栓、肝外轉(zhuǎn)移陰性、Child分級A級、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期肝癌患者組織中FAM96A的蛋白相對表達量均顯著高于腫瘤直徑≥5 cm、有門靜脈癌栓、肝外轉(zhuǎn)移陽性、Child分級B級、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者(均P<0.05)。見表2。

表1 肝癌組織與癌旁組織中FAM96A的mRNA及蛋白相對表達量情況對比

表2 肝癌組織中FAM96A的蛋白相對表達量與臨床病理特征的關(guān)系分析

2.3肝癌組織中FAM96A蛋白相對表達量與患者術(shù)后復(fù)發(fā)關(guān)系分析 肝癌組織中FAM96A蛋白低表達組術(shù)后1年復(fù)發(fā)率、術(shù)后2年復(fù)發(fā)率均顯著高于FAM96A蛋白高表達組(均P<0.05)。見表3。

表3 肝癌組織中FAM96A蛋白相對表達量與患者術(shù)后復(fù)發(fā)關(guān)系分析〔n(%)〕

3 討 論

目前臨床上治療肝癌患者的方式包括手術(shù)、放療、化療、介入治療等，早期肝癌患者在接受手術(shù)根治后的1年生存率可達80%以上，而5年生存率可達到50%〔5,6〕。然而，臨床上診治肝癌尚且存在早期診斷難度較大、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移風(fēng)險較高等問題〔7,8〕。因此，尋找一種可早期有效診斷肝癌，并準確判斷肝癌患者病情嚴重程度的手段顯得尤為重要。而隨著近年來相關(guān)研究的不斷深入，肝癌分子發(fā)病機制的研究成為臨床上醫(yī)務(wù)人員所關(guān)注的重點〔9,10〕。其中FAM96A與FAM96B是同源蛋白，主要是通過相互作用蛋白發(fā)揮功能，但其具體機制尚未完全明確。近年來有研究顯示，F(xiàn)AM96B可通過和甲基磺酸敏感性基因19和著色性干皮病基因D組成蛋白復(fù)合物發(fā)揮功能，且在肝癌及結(jié)腸癌組織中明顯低表達，參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程〔11,12〕。然而，迄今為止國內(nèi)外關(guān)于FAM96A的研究報道并不多見。

目前已有研究認為FAM96A通過參與細胞有絲分裂，起到調(diào)節(jié)細胞增殖、促進細胞凋亡的作用〔13〕。也有研究報道，F(xiàn)AM96A可能屬于抑癌基因，可能是通過間接作用，從而對肝癌的發(fā)生產(chǎn)生抑制作用〔14〕。有動物實驗證實，F(xiàn)AM96A對腫瘤細胞的生長具有抑制作用，且會誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡〔15〕。本研究結(jié)果與Stehling等〔15〕研究報道相符，提示FAM96A可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。因此，在臨床工作中可通過檢測FAM96A的表達情況，從而有助于早期診斷肝癌。此外，本研究表明肝癌組織中FAM96A的表達與患者病情進展情況存在密切相關(guān)。分析原因，筆者認為可能與以下幾個方面有關(guān)：①肝癌患者FAM96A失活，導(dǎo)致惡性腫瘤異常增殖，F(xiàn)AM96A表達越低則腫瘤增殖越嚴重〔16〕；②正常肝細胞中FAM96A表達較高，并起到調(diào)控細胞有絲分裂，促進細胞凋亡的作用，當(dāng)FAM96A失活或表達受到抑制時，肝細胞有絲分裂增加，凋亡降低，F(xiàn)AM96A表達越低腫瘤惡性程度越高〔17〕；③FAM96A基因沉默對腫瘤細胞增殖和生物學(xué)功能產(chǎn)生影響〔18〕。臨床工作中可通過檢測FAM96A的表達情況，從而有利于對肝癌患者的病情進行評估。另外，本研究結(jié)果也再次證實了隨著肝癌組織中FAM96A表達的不斷提高，患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險越高，F(xiàn)AM96A可能成為評估肝癌患者預(yù)后的生物學(xué)指標之一，具有較高的臨床檢測價值。

綜上，肝癌組織中FAM96A存在明顯低表達，且與腫瘤直徑、門靜脈癌栓、肝外轉(zhuǎn)移、Child分級以臨床分期密切相關(guān)，其表達水平的升高往往預(yù)示著預(yù)后良好。為臨床肝癌的診斷、治療及預(yù)后評估提供了新的靶點和思路。