徐歡 習小慶 鐘德平 鄭增斌

(1上饒市人民醫(yī)院泌尿外科，江西 上饒 334000；2南昌大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科)

前列腺癌是一種男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國因男性人口平均年齡的增長、泌尿系結(jié)石、前列腺增生等相關疾病發(fā)生率上升，煙草泛濫，生活中致癌危險因素的增多，前列腺癌的發(fā)生率快速上升〔1〕。前列腺癌診斷方法包括體格檢查、影像學檢查、標志物檢測，近年來基因檢測在惡性腫瘤診斷中的價值越來越受到重視，相較于其他診斷方法，可以實現(xiàn)量化分析，特異性更強〔2〕。有報道顯示，TMPRSS2-ERG基因融合在前列腺癌發(fā)生中扮演了重要角色，可能是癌變的先發(fā)事件〔3〕。本研究評價TMPRSS2-ERG融合基因檢測在前列腺癌診斷中的臨床價值。

1 材料與方法

1.1實驗材料 2010年10月至2018年10月上饒市人民醫(yī)院泌尿外科診治的15例前列腺癌手術患者為腫瘤組，年齡54～85歲，平均(67.8±2.5)歲。良性前列腺增生患者15例為增生組，年齡54～83歲，平均(67.4±2.3)歲。兩組年齡差異無統(tǒng)計學意義(χ2=6.24，P>0.05)。納入標準：①最終經(jīng)過病理檢查確診，腫瘤樣本參照Gleason指數(shù)分類細胞腫瘤分期系統(tǒng)(TNM)分類診斷；②組織保存完好；③在手術前，未進行放化療；④年齡≥60歲。排除標準：①組織樣本質(zhì)量差，無法進行基因檢測；②術前輔助放化療。

1.2儀器與試劑 普通冰箱，丹麥 Termobrite S500 原位雜交儀，愛特爾HSX-250恒溫水浴鍋，日本 XW-80A旋渦混合器，日本 OLYMPUS BX51熒光顯微鏡，湖南湘儀MINI-10K迷你離心機，北京SQX-4-CP FISH分析軟件，湖北泰維 R138型切片機，TEC2602烤片機，移液器。試劑包括二甲苯、甲醇、IGH雙色基因探針、ATM單色基因探針、乙醇溶液、去離子水、SSC緩沖液、變性液(70%甲酰胺/2×SSC，pH7.0～8.0)、洗滌液等。

1.3標本處理 采用4%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片厚度3 μm，二甲苯和梯度酒精水化，進行蘇木素-伊紅(HE)染色、FISH檢測。標本都采用甲醛溶液保存，在醫(yī)院按照常規(guī)的病理檢查、HE染色、免疫組化分析，常規(guī)方法無法診斷的對象，進行FISH檢測。本文選擇符合納入、排除標準的樣本。對于選擇的樣本，將病理切片采用二甲苯脫水、脫蠟2次，每次10 min，而后浸入到100%乙醇，5 min，而后梯度乙醇脫水。將組織切片浸入到去離子水，3 min，拭去多余的水分。90℃去離子水處理切片，30 min。將切片浸入到蛋白酶K消化液，37℃孵化，30 min，再使用2×SSC緩沖液，前后2次，每次10 min。常溫下，1%甲醛溶液處理，10 min，采用梯度乙醇脫水，自然干燥，加熱至56℃。

1.4融合基因檢測 采用熒光原文雜交檢測法檢測，在暗處將10 μl探針混合物(探針2 μl+雜交緩沖液8 μl)加至相應的玻片雜交區(qū)域，覆蓋蓋玻片并封片,雜交儀變性雜交過夜；雜交條件42℃16 h以上。雜交后用2×SSC和0.01%乙基苯基聚乙二醇(NP-40)/2×SSC洗滌液漂洗10 min，置70%乙醇中漂洗3 min；暗處自然干燥。將10 μl的4,6-聯(lián)脒-2-基吲哚二鹽酸鹽復染劑滴加在標記的雜交區(qū)域位置，并蓋上蓋玻片，暗處放置20 min后在熒光顯微鏡下觀察。使用熒光顯微鏡觀察樣本，評價圖像的質(zhì)量，選擇其中成像理想的區(qū)域，采用DP11顯微照相機對區(qū)域拍攝，VT FISH軟件處理數(shù)據(jù)，保存圖片、數(shù)據(jù)。VT FISH軟件通過分析熒光信號的不同顏色，分析細胞的基因表達信號強度，判斷是否為正常細胞或異常細胞，計算不同細胞的比重。選擇TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1，TMPRSS2-ETV4三種探針，每組探針檢測100個細胞，計算檢測閾值，閾值=平均值(M)+3×標準差(SD)。

1.5觀察指標 兩組FISH檢測結(jié)果，融合基因診斷前列腺癌的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、符合率。對比前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因陽性對象、陰性對象的血清PSA水平、前列腺Gleason評分水平。

1.6統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0軟件處理，計算TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4三組融合基因的閾值，對比兩組融合基因檢測結(jié)果，數(shù)據(jù)比較進行χ2檢驗或確切概率法，血清PSA水平、前列腺Gleason評分水平非正態(tài)分布，采用中位數(shù)與四分位距M(P25，P75)表示，非參數(shù)檢驗，P<0.05時表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1基因融合檢測結(jié)果 兩組TMPRSS2-ERG融合基因陽性及陰性分布、TMPRSS2-ETS融合基因陽性及陰性分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組TMPRSS2-ETV1融合、TMPRSS2-ETV4融合基因陽性及陰性分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2診斷效用 TMPRSS2-ERG融合基因診斷前列腺的靈敏度、符合率顯著低于TMPRSS2-ETS融合基因(P<0.05)。見表2。

2.3前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因臨床特征 前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因陽性對象的PSA顯著高于陰性對象，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，陽性及陰性對象的Gleason評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表1 兩組TMPRSS2四種融合基因檢測結(jié)果(n,n=15)

表2 TMPRSS2-ERG融合基因、TMPRSS2-ETS融合基因診斷前列腺癌效用對比(%)

與TMPRSS2-ERG相比:1)P<0.05

表3 前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因陽性及陰性對象PSA、Gleason評分對比〔M(P25，P75)〕

與陰性相比:1)P<0.05

3 討 論

ERG基因主要包括調(diào)控生長因子及其受體、參與信號傳導及細胞周期相關基因調(diào)控，調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)發(fā)育與分化，ERG基因與白血病、惡性腫瘤發(fā)生關系密切〔3〕。TMPRSS2基因結(jié)構(gòu)集中在前列腺基底細胞、前列腺癌細胞中。因此TMPRSS2-ERG融合基因與前列腺基底細胞惡性病變關系密切。TMPRSS2-ERG是前列腺癌常見的基因融合類型，T-E融合基因通過與雄激素受體、依賴蛋白激酶催化亞基(DNA-PKcs)、核因子κB、含半胱氨酸分泌蛋白3的相互作用，誘發(fā)前列腺癌〔4〕。

本研究顯示，TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETS融合基因在良性前列腺疾病、前列腺癌中的分布存在顯著差異。本文采用的病理樣本檢測基因，理論上更能反映融合基因與前列腺病變之間的關系，良性惡性對象融合基因差異應相較于尿液、血液檢測更為顯著。有報道顯示兩種疾病的TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4融合基因異常率也存在顯著的差異，這可能與本研究中納入對象例數(shù)較少、研究方法差異有關〔5〕。有報道顯示，檢測血清中TMPRSS2相關融合基因也可以輔助診斷前列腺癌，但是不同檢測方法顯然會影響檢測的結(jié)果。 不同文獻報道的前列腺癌TMPRSS2-ERG表達存在較大的差異，發(fā)生率為40%～80%〔6〕。本研究中前列腺癌對象為53.3%，處于正常水平，T-E融合基因在少數(shù)病例中會產(chǎn)生融合蛋白，同時產(chǎn)生序列時間短，不參與生物學活動，可以忽略。反映了TMPRSS2-ERG融合基因可能與臨床特征有關，不同研究中的前列腺癌發(fā)生機制、流行病學存在差異，從而導致T-E融合基因異常率存在差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，前列腺癌、良性前列腺增生對象TMPRSS2-ETS融合基因陽性及陰性分布差異有統(tǒng)計學意義，且這種差異較TMPRSS2-ERG融合更為顯著，但是有關于該基因融合的研究非常少，今后需要進一步分析該融合在前列腺癌發(fā)生中的起作用機制。

本研究TMPRSS2-ERG陽性對象的PSA高于陰性對象，與其他文獻〔7〕報道的結(jié)果并不一致，這可能與納入樣本PSA檢測的質(zhì)控水平有關，PSA容易受到前列腺炎癥活動影響。本研究未得出陽性及陰性對象的Gleason評分差異顯著的結(jié)論，相關文獻〔8〕報道TMPRSS2-ERG融合基因與Gleason評分的關系結(jié)論存在較大的差異，這與流行病學特征存在差異有關，反映了TMPRSS2-ERG融合基因與前列腺癌復雜關系。TMPRSS2-ERG融合基因異常可能是前列腺癌的始動因素，即在惡性突變中可能發(fā)揮了關鍵的作用，但是在腫瘤的發(fā)生、進展過程中的作用可能并不強。有文獻〔9〕報道顯示，TMPRSS2-ERG融合基因異常并不是前列腺癌發(fā)生的必要條件，即其靈敏度相對較低，特異性相對較高，可以達到100%，可以降低假陽性率。有關于前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因陽性的影響因素研究較少，從國內(nèi)外研究來看，存在顯著人種差異，若能結(jié)合因素分析，可以更好地提升TMPRSS2-ERG融合基因診斷前列腺癌價值。

本研究僅對病理組織中的融合基因進行檢測，而想要獲得病理組織，便必須進行手術或活檢，TMPRSS2-ERG融合基因檢測可能無法作為活檢的依據(jù)，而是作為活檢病理檢查的輔助指標，這削弱了TMPRSS2-ERG融合基因檢測的價值。目前許多基因檢測都陷入了這樣的困境，即許多結(jié)果都是基于病理組織而得出的，無法作為活檢適應證依據(jù)。而目前前列腺癌篩查診斷中活檢存在過度的風險，對于PSA陽性的對象活檢率居高不下，因此需控制不必要的活檢。從這一角度來看，今后需要開展血液、尿液TMPRSS2-ERG融合基因檢測研究，以發(fā)揮TMPRSS2-ERG融合基因檢測強特異性的優(yōu)勢，與血清PSA檢測一起指導活檢，排除PSA假陽性的風險，避免不必要的活檢。近年來，有學者嘗試采用聚合酶鏈式反應檢測尿液中的T-E融合基因，減少了活檢，直接消除了患者活檢產(chǎn)生的緊張情緒，這種非侵入性檢測更易被接受〔10〕。

TMPRSS2-ERG融合基因檢測在前列腺癌診斷中有一點的價值，盡管診斷效用不如TMPRSS2-ETS融合基因，但是可以進一步評估血清PSA檢測結(jié)果，配合其他檢查評估疾病惡性風險。今后需要探索尿液TMPRSS2-ERG融合基因檢測方法，以作為篩查技術，指導活檢，同時還可以作為疑難病例診斷的證據(jù)，避免誤診。