李賽蓮 許保 陳正義 黃曉曦 陳建強(qiáng)

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院消化內(nèi)科，海南 海口 570208)

結(jié)直腸癌為臨床常見的一種消化道惡性腫瘤，最近研究顯示，結(jié)直腸癌的臨床發(fā)病率及病死率呈上升趨勢(shì)，但目前臨床對(duì)其發(fā)生及發(fā)展機(jī)制尚未完全明確〔1〕。由于結(jié)直腸癌早期癥狀較為隱匿，多數(shù)患者就診時(shí)已為進(jìn)展期，或失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)，而放化療治療效果不明顯。目前，腫瘤標(biāo)志物糖類抗原(CA)199及癌胚抗原(CEA)已被應(yīng)用于結(jié)直腸癌的臨床診斷，李少蘭研究發(fā)現(xiàn)CEA、CA199診斷結(jié)直腸癌的靈敏度分別為61.67%、34.67%〔2〕。蔡尚黨等〔3〕學(xué)者研究報(bào)道，CEA、CA199診斷結(jié)直腸癌的靈敏度分別為60.87%、36.96%，由此可見，CEA、CA199診斷結(jié)直腸癌的靈敏度欠佳。miRNA是一類長(zhǎng)度為18～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小RNA，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、代謝等生物學(xué)過程，其異常表達(dá)與惡性腫瘤密切相關(guān)〔4〕。近年有學(xué)者報(bào)道，miR-335在胃癌〔5〕、宮頸癌〔6〕、非小細(xì)胞肺癌〔7〕等多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，但臨床對(duì)miR-335與結(jié)直腸癌的研究報(bào)道較少。本研究旨在分析結(jié)直腸癌患者血清及組織中miR-335的表達(dá)變化特點(diǎn)，明確miR-335在結(jié)直腸癌臨床診療中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2017年12月中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院消化內(nèi)科收治的98例結(jié)直腸癌患者，排除肛管癌、結(jié)直腸多發(fā)性息肉及家族性腺瘤性息肉病等其他惡性腫瘤者。男53例，女45例；年齡39～74〔平均(54.80±4.72)〕歲；腫瘤直徑1.7～9.2 cm；腫瘤類型：直腸癌65例，結(jié)腸癌33例；分化程度：高分化21例，中分化49例，低分化28例；臨床分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期39例，Ⅲ期26例，Ⅳ期6例；31例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，67例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。另選取同期來院體檢健康的90例居民作為對(duì)照組，男47例，女43例；年齡37～66〔平均(53.05±3.19)〕歲。兩組性別及年齡比較無顯著差異(P>0.05)。本研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2樣本收集 分別采集兩組清晨空腹靜脈血5～8 ml，結(jié)直腸癌患者于治療前采集，健康對(duì)照組于體檢當(dāng)日采集，將采集的樣本于48 h內(nèi)經(jīng)離心(1 000 r/min，10 min)處理后取上清液，置于-80℃冰箱中保存待檢。于術(shù)后15 min內(nèi)收集結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織樣本(距癌組織邊緣≥2 cm)，保存于-80℃冰箱中待檢。

1.3miR-335檢測(cè) 取待測(cè)樣本，按TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，DEPC水溶解，然后取1 μl RNA檢測(cè)其完整性。應(yīng)用光度計(jì)分別檢測(cè)血清及組織樣本中RNA的純度及濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為20 μl：總RNA 1.0 μl、50 U/μl MultiScribeTM Reverse Transcriptase 1.0 μl、10×RT緩沖液 1.5 μl、100 mmol/L dNTPs 0.15 μl、20 U/μl RNA酶抑制劑0.19 μl、1 μmol/L逆轉(zhuǎn)錄特異性引物3 μl，加DEPC水補(bǔ)至20 μl。反應(yīng)條件：16℃ 15 min，42℃ 60 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min，反應(yīng)產(chǎn)物置于4℃保存。miRNA-335逆轉(zhuǎn)錄引物序列為：5'-GUUGAGUUCUCUAGAUCAGACCUGGCGAUAAGGACCCGUGAGGCACUCUACCA-3'；U6逆轉(zhuǎn)錄引物序列為：5'-CGCTTCATTCGACGTATGGCATT-3'。以cDNA為模板行PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為25 μl：2×All-in-OneTM Q-PCR Mix 10 μl、50×ROX Reference Dye 0.4 μl、上游引物2 μl、下游引物2 μl、cDNA模板 2 μl，加Nuclease-Free Water補(bǔ)至20 μl。反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-335的相對(duì)表達(dá)量。miRNA-335上游引物：5'-AUGAGUGCGCGCUCGAUUAAGCC-CUAUUGUCAUCAUGGAACAUG-3'，下游引物：5'-AGCUCGCACUCAGAAUACAGUCU-3'；U6上游引物：5'-CTCTCCGGTGCAACGCA-3'，下游引物：5'-AGCACTCACGTATTATGTCG-3'。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析，受試者工作特征(ROC)曲線分析miR-335在結(jié)直腸癌診斷中的價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1血清和組織樣本中miR-335表達(dá)水平 結(jié)直腸癌組患者血清中miR-335的相對(duì)表達(dá)量為(0.63±0.18)，癌旁正常組織組血清中miR-335的相對(duì)表達(dá)量為(0.94±0.25)，健康對(duì)照組血清中miR-335的相對(duì)表達(dá)量為(1.09±0.34)，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.103，P=0.000)；與癌旁正常組織比較，結(jié)直腸癌組織中miR-335的相對(duì)表達(dá)量明顯下降(t=7.415，P=0.000)；與健康對(duì)照組比較，結(jié)直腸癌組患者血清中miR-335的相對(duì)表達(dá)量明顯下降(t=9.276，P=0.000)。

2.2結(jié)直腸癌患者血清和癌組織中miR-335的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 不同臨床分期、分化程度及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者血清和癌組織中miR-335的相對(duì)表達(dá)量比較差異顯著(P<0.05)；不同性別、年齡、腫瘤直徑及腫瘤類型的結(jié)直腸癌患者血清和癌組織中miR-335的相對(duì)表達(dá)量比較無顯著差異(P>0.05)，見表1。

2.3ROC曲線分析

2.3.1血清中miR-335對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能 由ROC曲線可知，其曲線下面積為0.837(95%CI：0.602～1.483)，診斷靈敏度為93.29%，特異度為80.71%，見圖1。

2.3.2癌組織中miR-335對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能 由ROC曲線可知，其曲線下面積為0.901(95%CI：0.711～2.169)，診斷靈敏度為94.97%，特異度為82.35%，見圖2。

表1 結(jié)直腸癌患者血清和癌組織中miR-335的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 血清中miR-335對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能ROC曲線

圖2 癌組織中miR-335對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能ROC曲線

3 討 論

miRNA可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶基因mRNA分子3'UTR特異性結(jié)合，降低靶基因穩(wěn)定性或抑制其翻譯，從而實(shí)現(xiàn)靶基因沉默，是基因轉(zhuǎn)錄后水平的重要調(diào)控方式〔8,9〕。有研究報(bào)道，多種miRNA在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)異常，如miR-21〔10〕、miR-1011〔11〕、miR-200 b及miR-200c〔12〕，提示miRNA與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展存在一定關(guān)系。由于結(jié)直腸癌早期癥狀較為隱匿，多數(shù)患者就診時(shí)已為進(jìn)展期，或失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)，其臨床病死率呈逐年升高趨勢(shì)〔13〕。因此，探究miRNA與結(jié)直腸癌發(fā)生進(jìn)展的臨床關(guān)系意義重大。miR-335作為一種腫瘤抑制因子，在乳腺癌、肝癌、肝內(nèi)膽管癌、肺癌等多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔14〕。此外，miRNA還存在于人體血液中，外周血miRNA可作為一項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物。有學(xué)者研究報(bào)道，肝癌患者血清中miR-335表達(dá)水平降低，miR-335有望成為診斷肝癌的一個(gè)新的血清標(biāo)志物〔15〕。另有學(xué)者研究報(bào)道，miR-335在乳腺癌血清腫表達(dá)穩(wěn)定〔16〕，由此可見，臨床對(duì)血清miR-335與惡性腫瘤的關(guān)系研究報(bào)道結(jié)果不盡一致。

本研究結(jié)果顯示，miR-335在結(jié)直腸癌患者血清和癌組織中均呈低表達(dá)，且其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。