夏悅 賴維 劉玉芳 張杰 鄭躍

中山大學附屬第三醫(yī)院皮膚科，廣州 510630

皮膚慢性紫外線損傷（光老化）不僅影響容貌，還可造成皮膚完整性及免疫系統(tǒng)的損害，甚至可引發(fā)光線性肉芽腫等多種光相關疾病，嚴重者可導致基底細胞癌、鱗狀細胞癌和惡性黑素瘤等皮膚腫瘤［1-2］。皮膚光老化的機制至今未明，紫外線對皮膚細胞的基因損傷在其發(fā)生機制中起重要作用。已有研究表明，DNA 損傷以及DNA 修復異常參與皮膚慢性光損傷的發(fā)生［3-5］，反復紫外線照射可以引起多種類型DNA 損傷，包括形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體、胸腺嘧啶二聚體等［6-7］，是光源性皮膚腫瘤發(fā)生的物質基礎。但長期反復長波紫外線（UVA）照射對人皮膚成纖維細胞DNA損傷修復及復制過程的影響目前仍不清楚，因此，我們對此進行研究。

材料與方法

一、材料

1.皮膚成纖維細胞：來自中山大學附屬第三醫(yī)院泌尿外科3例兒童包皮環(huán)切術后包皮組織，年齡5 ～7歲。本研究通過中山大學附屬第三醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批準號［2016］2-44），患兒家屬均簽署知情同意書。

2.試劑和儀器：DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青-鏈霉素（美國Gibco公司），細胞衰老半乳糖苷酶（SA-β-Gal）試劑盒（美國Cell signaling technology 公司），細胞凋亡試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。UVA照射儀（Sigma SS-03A，燈管為Philips UVATLl0RS，波長320 ～400 nm）和UVA照射計均產自上海希格瑪高科技有限公司。RNA 逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）、NanoPhotometer?分光光度計（美國IMPLEN 公司）、RNA 檢測試劑盒（美國Agilent Technologies 公 司）、熒光定量儀 Qubit?3.0 Flurometer（美國Life Technologies 公司），二代測序RNA 文庫制備試劑盒（英國NEB 公司）、PCR 試劑盒（英國QIAGEN 公司）、核酸純化試劑盒（北京艾德科技有限公司）。

二、方法

1.原代皮膚成纖維細胞培養(yǎng)：取兒童包皮，參照文獻［8］分離培養(yǎng)皮膚成纖維細胞，培養(yǎng)至第3 代凍存，取細胞復蘇后10 代以內的細胞行后續(xù)實驗。

2.建立皮膚成纖維細胞慢性光損傷模型：將3 ～6代成纖維細胞按1×106/皿接種于直徑6 cm的細胞培養(yǎng)皿，待細胞長到70%融合時，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次后，加2 ml PBS將細胞分為UVA組和對照組。。參照文獻［8-10］，將UVA 組細胞置于UVA 輻照儀下，細胞距離光源15 cm，平均照射功率12.7 mW/cm2，單次照射時間為780 s，照射劑量為 9.9 J/cm2，照射結束后 PBS 洗滌 1 次，加入 2 ml DMEM培養(yǎng)基，每24 h照射1次，連續(xù)照射14 d。對照組細胞加入PBS后置于超凈臺避光，在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d。

3.MTT法檢測皮膚成纖維細胞增殖活性：將末次UVA照射后成纖維細胞按每孔5×103個接種于96孔培養(yǎng)板中，每組各設3個復孔。細胞培養(yǎng)24 h后，每孔加10 μl CCK8 試劑，37 ℃孵育4 h，在酶聯免疫檢測儀上測定450 nm 處吸光度（A值）。細胞活性（%）=（AUVA照射組-A空白孔）/（A對照組-A空白孔）×100%，實驗重復3次，取均值。

4.β半乳糖苷酶染色檢測細胞老化比率：末次UVA 照射后 48 h 去除DMEM培養(yǎng)基，PBS 洗 滌1次，按照試劑盒說明書檢測兩組細胞老化。顯微鏡下老化細胞胞質被染成藍色，每皿至少計數500個細胞，計算陽性細胞所占百分比。實驗重復3次，取均值。

5.流式細胞儀檢測細胞凋亡率：末次UVA照射后，用胰蛋白酶消化細胞，調整細胞為1×106/ml。每組取1 ml細胞，預冷PBS洗滌3次后細胞重懸于200 μl結合緩沖液。加入10 μl異硫氰酸熒光素標記的膜聯蛋白V，避光反應20 min，沖洗固定后，加入0.5 ml 碘化丙錠染色，4 ℃反應30 min。加入300 μl 結合緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次，取均值。

6.表達基因譜分析：將UVA 組和對照組細胞分別使用RNA 逆轉錄試劑盒將全部基因完整轉錄為總RNA，使用NanoPhotometer?分光光度計檢測樣品的純度和粗濃度，隨后用熒光定量儀Qubit?3.0 Flurometer檢測RNA樣品準確濃度，RNA檢測試劑盒檢測RNA 樣品完整性。檢測合格后，對照組及UVA組各取0.5 ～5 μg總RNA，根據二代測序RNA 文庫制備試劑盒的操作步驟，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，隨后將mRNA打斷成短片段，以mRNA 為模板，用六堿基隨機引物合成單鏈cDNA，然后合成雙鏈cDNA，隨后利用PCR 試劑盒純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加尾并連接測序接頭，用核酸純化試劑盒回收目的基因片段后進行PCR 富集，獲得cDNA文庫。

cDNA 測序：先通過 qPCR，對 cDNA 的有效濃度進行準確定量（濃度＞10 nmol），隨后使用HiSeq SR Cluster Kit v4-cBot-HS（Illumia）試劑在cBot上生成簇，之后用HiSeq 2500 測序平臺對收集的cDNA樣本進行測序。

KEGG差異表達富集分析：將對照組與UVA組的cDNA測序結果進行比較，對差異表達的基因通過基因組破譯數據庫（http：//www.kegg.jp/）進行京都基因與基因組百科全書分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），對染色體的全部基因表達蛋白在細胞活動過程中的蛋白交互作用網絡作出預測。然后對KEGG 中每個信號通路應用超幾何檢驗進行富集分析，找出差異表達基因中顯著富集的信號通路。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件。兩獨立樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、皮膚成纖維細胞慢性光損傷模型的建立

UVA 組細胞體積變大，細胞內顆粒增多，出現慢性光損傷表型（圖1），細胞活性明顯低于對照組，細胞老化率和凋亡率均高于對照組（P＜0.05）。見表1。

二、關鍵酶差異表達基因檢測

在 DNA 錯配修復、DNA 復制和 DNA 堿基切除修復過程的關鍵酶中，UVA 組和對照組細胞之間出現表達差異的為DNA連接酶（Lig）1、核糖核酸酶H（RNaseH）2A 以及解旋酶Dna2，UVA 組上述基因表達水平均低于對照組（P＜0.01）。見表2。

圖1 顯微鏡下觀察反復長波紫外線（UVA）照射誘導皮膚成纖維細胞慢性光損傷（×100） UVA 組細胞與對照組相比體積變大，細胞內顆粒增多，出現慢性光損傷表型

表1 長波紫外線（UVA）反復照射對成纖維細胞活性、老化率、凋亡率的影響（，%）

表1 長波紫外線（UVA）反復照射對成纖維細胞活性、老化率、凋亡率的影響（，%）

注：n=3

UVA照射組對照組t值P值細胞凋亡率29.0±3.3 6.0±5.9 5.89＜0.05細胞活性72.0±5.2 96.0±3.7 6.51＜0.05細胞老化率79.7±5.2 6.4±0.8 24.12＜0.05

表2 長波紫外線（UVA）照射誘導皮膚成纖維細胞慢性光損傷過程中差異表達的DNA復制及修復關鍵酶基因

三、關鍵酶差異表達對皮膚成纖維細胞DNA修復的影響

KEGG分析顯示，UVA誘導人皮膚成纖維細胞慢性光損傷后，在DNA 堿基修復過程，Lig 表達下調，導致 DNA 單堿基修復受阻，Lig 及 Lig1 表達下調導致DNA 多堿基修復過程受阻；在DNA 錯配修復過程，由于Lig1 基因表達下調，即使DNA 內切酶、復制因子C（RFC）、錯配修復酶（PMS2）、DNA錯配切割酶（Mut）家族及其同源蛋白家族（MLH1、MLH2、MLH3、MLH6、PMS2）、DNA 復 制 蛋 白（RPA）、DNA 聚合酶（ExoI）表達無明顯變化，修復過程亦受阻；在DNA 復制過程，RNaseH2A、Dna2、Lig1表達下調，復制過程受阻。

討 論

引起皮膚光老化的機制復雜多樣，主要涉及DNA 損傷、氧化應激、基質金屬蛋白酶、炎癥反應等方面。紫外線作用于皮膚表皮角質形成細胞，可引起細胞DNA 損傷，進而引發(fā)皮膚炎癥、免疫抑制，嚴重時可導致皮膚腫瘤［11］。我們在2017年使用高通量測序方法，發(fā)現慢性紫外線照射人皮膚成纖維細胞，可引起607條基因表達改變，其中238條基因表達上調，369 條基因表達下調，這些表達改變的基因參與細胞的多種生物過程，包括細胞代謝、細胞內成分合成、細胞功能及信號通路［12］。本研究是在前期發(fā)現差異表達基因的基礎上，研究慢性紫外線照射對人皮膚成纖維細胞DNA復制及修復過程的影響。

在哺乳動物細胞中，目前研究較多的DNA 修復通路包括核苷酸切除修復、堿基切除修復、重組修復和錯配修復。機體的DNA 損傷修復系統(tǒng)可對損傷的DNA 進行修復來維持DNA 的完整性，修復失敗或錯誤修復則可導致細胞凋亡以及可能導致腫瘤的發(fā)生。已有研究表明，DNA 損傷修復異常與多種皮膚病發(fā)生密切相關［13］。Yu 和 Lee［14］針對紫外線照射導致細胞活性氧的產生增加直接致DNA 損傷機制進行研究，并闡述了許多紫外線引起的癥狀與核苷酸切除修復密切相關。本研究顯示，UVA 誘導人皮膚成纖維細胞慢性光損傷后，DNA 單堿基切除修復關鍵酶、DNA 錯配修復關鍵酶以及DNA復制關鍵酶表達均出現改變。

Lig 參與多種DNA 修復，可獨立完全修復部分DNA 單鏈斷裂。我們研究發(fā)現，在UVA 反復刺激后，皮膚成纖維細胞的堿基切除修復、錯配修復、DNA 復制過程中均出現Lig1 的表達下調，提示UVA 通過抑制Lig1 表達，影響細胞DNA 的修復過程及復制過程。

DNA解旋酶作用于DNA兩條單鏈中間連接的堿基的氫鍵上，進而使兩條單鏈在該處分開。RNaseH 是一種核糖核酸內切酶，能夠特異性地水解雜交到DNA 鏈上的RNA 磷酸二酯鍵，故能分解RNA/DNA 雜交體系中的RNA 鏈。本研究顯示，UVA 反復刺激皮膚成纖維細胞，主要通過抑制Lig1、RNaseH2A、Dna2 基因表達，影響細胞DNA 的正常復制過程，進而通過下游的生物學效應，引起細胞損傷及相關疾病發(fā)生。

近來一些新的研究表明，通過干預DNA 的損傷修復，可以預防紫外線誘發(fā)的皮膚光老化及相關皮膚病（包括皮膚腫瘤）［15］。Joo 等［16］證明，栝樓提取物通過調節(jié)BMAL1（brain and muscle aryl hydrocarbonreceptornucleartranslocatorlikeprotein 1）和miR-142-3p的表達來增強UVB誘導的DNA損傷修復，提出TKE 可作為治療與UVB 誘導的損傷相關皮膚病的潛在候選者。Shah和He［17］研究紫外線誘發(fā)的DNA 修復的分子機制，提出可通過調節(jié)核苷酸切除修復過程來預防癌癥發(fā)生和發(fā)展。Panich 等［18］進一步證明紫外線在誘導皮膚干細胞衰老過程中的損傷和氧化應激作用，并提出一種新的抑制皮膚細胞慢性光損傷發(fā)生的方法。

綜上，本研究表明，重復UVA照射可直接作用于皮膚成纖維細胞DNA 堿基切除修復、DNA 錯配修復及DNA 復制過程中關鍵酶的基因表達，從而影響皮膚成纖維細胞DNA 修復及DNA 復制過程，參與皮膚慢性光損傷的發(fā)生。該發(fā)現不僅進一步闡明了皮膚老化和光損傷的發(fā)生和修復機制，還可能為日后進一步研究皮膚光損傷及相關皮膚病的防治措施提供思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突