朱曉翠 宮倩紅

摘 要 透明質酸酶是廣泛分布于自然界的一類糖苷酶，不僅能夠作為工具酶制備低分子量透明質酸和透明質酸寡糖，還可用于促進藥物吸收以及創(chuàng)傷后局部水腫消散，因其多種生物學活性而廣泛應用于工業(yè)和臨床。本文對PL-8家族細菌透明質酸酶的三維結構特征和底物的催化作用機制進行綜述。

關鍵詞 PL-8家族 透明質酸酶 結構特征 催化作用機制

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A

透明質酸酶（hyaluronidase， HAase）是一類能夠降解透明質酸的糖苷酶，主要降解透明質酸，同時能夠在一定程度上降解硫酸軟骨素（Chondroitin sulfates， CS）。透明質酸酶由Duran-Reynals在1929年首次發(fā)現于哺乳動物睪丸及其他組織提取物中，可作為一種“擴散因子”促進疫苗、染料和毒素擴散。

基于氨基酸序列同源性分析，可以將透明質酸酶分為兩大類：真核生物來源透明質酸酶和原核生物來源透明質酸酶。真核生物來源透明質酸酶主要是從動物組織器官（如牛、羊睪丸透明質酸酶等）中提取，但動物組織提取原料有限、純化工藝復雜、價格昂貴、而且存在病毒感染的風險。原核生物透明質酸酶主要來源于細菌和噬菌體中，來源廣泛，純化工藝簡單，成本較低，具有較好的市場應用價值，因此細菌來源透明質酸酶已成為目前的研究熱點。在CAZY數據庫中，細菌透明質酸裂解酶主要歸屬于PL-8和PL-16裂解酶家族，但兩個家族的透明質酸酶在三維結構和催化機制方面存在明顯不同。本文主要對PL-8家族透明質酸酶的三維結構特征和底物的催化作用機制進行綜述。

1 PL-8家族三維結構特征

PL-8家族是糖胺聚糖裂解酶家族，目前做過性質研究的共有27種，主要包括透明質酸酶、硫酸軟骨素酶和黃原膠酶。目前已經闡明了PL-8家族多種透明質酸酶的X射線晶體結構，研究表明，PL-8家族細菌透明質酸酶主要由三個結構域組成，分別是N端結構域，間隔區(qū)和C端結構域。其中結晶的天然肺炎鏈球菌酶分子由具有（%Z/%Z）5-6的%Z-螺旋桶結構的主要催化結構域和反平行%[折疊組成的C-末端結構域組成。無乳鏈球菌（S. agalactiae）透明質酸酶的結構類似于肺炎鏈球菌（S. pneumoniae）透明質酸酶，但N末端包含另外的結構域，起到間隔結構域的作用。C-末端%[-折疊結構域的功能是調節(jié)聚合物HA/ Ch / ChS底物進入%Z-螺旋催化結構域中的催化裂縫，整個催化裂縫穿過%Z-螺旋區(qū)域，其中六糖單元剛好結合在催化裂縫內酶的活性位點存在于桶狀結構的催化裂縫中，由三個殘基組成：Asn349，His399和Tyr408。

2底物結合裂縫

PL-8家族細菌透明質酸裂解酶的共同結構特征是它們都有一個細長的底物結合裂縫用于容納底物。在鏈球菌透明質酸酶中就存在這樣的底物結合裂縫，該酶含有一個由%Z螺旋組成的扭曲的（%Z/%Z）5-6桶，底物結合裂縫嵌套在%Z螺旋中，促進HA結合。在這些結構中，裂縫由從%[-螺旋鏈的表面延伸的環(huán)組成。并且在幾種多糖水解酶中也發(fā)現了這種%[-螺旋折疊，例如鼠李糖半乳糖醛酸酶A和噬菌體P22的尾部刺突蛋白，這意味著裂縫特異的有利于多糖底物的結合。在一些酶中，裂縫被覆蓋以形成特異于細胞水解酶的結構。這種裂縫的這一重要特征是它們主要具有正電性和疏水性，因此促進帶負電荷的疏水性HA / Ch / ChS底物的結合。因此該過程由酶和聚合物的相互作用以及它們產生的電荷電勢驅動，反應的能量可能由糖苷鍵降解時發(fā)生的放熱反應產生。

3催化作用機制

根據文獻報道，PL-8家族透明質酸酶的作用機制是%[-消除反應，主要表現為質子接受和捐贈（Proton acceptance and donation， PAD）。

以鏈球菌透明質酸酶為例，催化機制主要分為以下幾個步驟：（1）透明質酸底物與酶的底物結合裂縫緊密結合;（2）通過透明質酸酶的Asn作為電子吸收劑酸化HA的葡糖醛酸殘基的C5碳原子;（3）通過酶的His殘基奪走C5質子，然后在糖苷鍵的還原側上的葡糖醛酸的C4和C5之間形成不飽和鍵;（4）從酶的Tyr殘基中提供質子后裂解糖苷鍵;（5）最后，HA二糖產物從活性位點離開，并通過與水環(huán)境的酶交換平衡氫離子，然后酶用于下一輪催化。對于底物的逐步降解，HA通過一個二糖單元向鏈的還原端移位，并使用PAD機制進行脫水降解。在該過程中，C4和C5碳原子從sp3變?yōu)閟p2雜交，其中糖環(huán)的產物構象發(fā)生相應的變化，最后變?yōu)榘胍问綐嬒?。除了三個催化殘基外，其他殘基還涉及酶作用的重要方面：疏水殘基Trp291，Trp292和Phe343，以及Glu388，Asp398和Thr400可能在裂縫末端產生負電位。與底物相互作用的疏水性區(qū)域發(fā)揮催化作用，而負電荷區(qū)域促進產物的釋放。

4展望

關于透明質酸酶的研究已有80余年的歷史，因其具有多種生物學活性，透明質酸酶已被廣泛應用于工業(yè)和醫(yī)療領域，如制備透明質酸寡糖、眼科治療、美容整形和促進藥物擴散等。由于細菌透明質酸酶來源廣泛，純化工藝簡單，且生產成本較低，因此成為近年來的研究熱點之一。但有關細菌來源透明質酸酶的催化作用機制、底物特異性和促進皮下藥物擴散的作用仍有待深入研究。相信隨著研究的進一步深入，細菌來源透明質酸酶將為皮下藥物擴散和腫瘤靶向治療帶來新的希望。