周怡然，陳蓓麗，朱 靜，章志國，曹云霞

不育癥是生殖研究中的常見疾病，在引起男性不育的諸多因素中，染色體異常是重要因素之一。而Y染色體微缺失是一種常見的染色體異常。常見的Y染色體微缺失發(fā)生在Y染色體的無精子因子(azoospermia factor， AZF)區(qū)域，位于Y染色體長臂，與大多數(shù)原發(fā)性的無精子癥密切相關(guān)。Y染色體微缺失尤其是AZF區(qū)域的微缺失在男性不育癥中的影響目前已受到普遍關(guān)注。隨著輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)尤其是體外受精(in-vitrofertilization，IVF)及卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技術(shù)逐漸成熟，Y染色體微缺失的患者在行ART助孕時，除了無精子癥患者多選擇供精助孕治療外，大多數(shù)有精子的Y染色體微缺失的患者選擇進(jìn)行ICSI助孕，然而相關(guān)結(jié)局的報道并不多見。該研究目的是對Y染色體微缺失患者行ICSI助孕的妊娠結(jié)局及相關(guān)影響因素進(jìn)行分析，為Y染色體微缺失患者助孕方式的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例資料2011年3月～2019年1月于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心就診的男性不育患者共有998例行Y染色體微缺失篩查。其中131例Y染色體存在微缺失，867例未見缺失位點?，F(xiàn)將經(jīng)檢測存在Y染色體微缺失的周期作為A組，經(jīng)檢測未見缺失位點的作為B組，此外納入同時期男方各項檢查正常僅因女方輸卵管因素采用ART助孕的 1 247個周期作為C組。A組作為觀察組，分別與B組和C組進(jìn)行比較。

納入標(biāo)準(zhǔn)：① 由于納入的早期病例多采用WHO第4版的分析標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行疾病的診斷，為更好地進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)分析中仍采用WHO第4版的分析標(biāo)準(zhǔn)，精子濃度：≥ 20×106/ml，精子活力：a>25%或a+b>50%。② 女方篩選標(biāo)準(zhǔn)：年齡<40周歲，無染色體異常，診斷中無多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥及卵巢早衰等已知明顯影響輔助生殖結(jié)局的原發(fā)疾病。

1.2 檢測方法所有進(jìn)行Y染色體篩查的患者均使用EDTA抗凝管留取外周靜脈血送我院中心試驗室檢驗。檢測中各序列標(biāo)簽位點均根據(jù)歐洲男科協(xié)會(EAA)及歐洲分子遺傳實驗質(zhì)控協(xié)作網(wǎng)(EMQN)所推薦的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計。通過多重PCR檢測及電泳確認(rèn)微缺失位點。進(jìn)行檢測的每個樣本均已設(shè)立Y染色體性別決定基因作為內(nèi)參進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.3 觀察指標(biāo)胚胎情況的指標(biāo)包括受精率與優(yōu)質(zhì)胚胎率。IVF周期中正常受精率=[雙原核(two pronucleus, 2PN)數(shù)/獲卵數(shù)]×100%，ICSI周期中正常受精率=(2PN數(shù)/MⅡ卵子數(shù))×100%。優(yōu)質(zhì)胚胎率=(優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/胚胎數(shù))×100%。

妊娠結(jié)局中觀察指標(biāo)均指精液來源為丈夫射出、顯微睪丸取精、睪丸穿刺和附睪穿刺的IVF/ICSI周期。妊娠率=(妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù))×100%，流產(chǎn)率=(流產(chǎn)周期數(shù)/妊娠周期數(shù))×100%。為排除多次胚胎移植對妊娠結(jié)局的影響，移植周期數(shù)均指新鮮移植周期或第1次解凍移植周期的妊娠結(jié)局。

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況及精液常規(guī)在進(jìn)行Y染色體微缺失篩查的998例患者中，共檢測出131例發(fā)生Y染色體微缺失，發(fā)生率為13.12%。檢測后A組與B組和C組比較時，在身高、體質(zhì)量、不育年限上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。A組年齡顯著小于C組。

分別比較A組與B組及A組與C組患者的精液常規(guī)結(jié)果，精液量、精液pH的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；而B組與C組的精液密度與精液活力指標(biāo)均高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 Y染色體AZF區(qū)域各缺失類型及臨床表型分析該131例已篩查出Y染色體微缺失的患者均為原發(fā)性不育癥。其中以無精子癥和嚴(yán)重少弱精子癥最為多見，也可見于少精子癥及弱精子癥，臨床診斷多與睪丸的生精功能低下或障礙相關(guān)。根據(jù)Y染色體AZF區(qū)缺失的位置不同對131例經(jīng)篩查發(fā)現(xiàn)Y染色體具有缺失的患者進(jìn)行分類統(tǒng)計，其中除了單一的a、b、c、d區(qū)位點缺失，也包括多個區(qū)域位點的聯(lián)合缺失。

包括AZFa區(qū)的缺失發(fā)生率最低，共6例(2例a區(qū)缺失、2例abc區(qū)域聯(lián)合缺失、1例abcd區(qū)聯(lián)合缺失、1例ac區(qū)域聯(lián)合缺失)，均為非梗阻性無精子癥患者。包括AZFb區(qū)的缺失共20例(6例b區(qū)缺失、8例bc區(qū)域聯(lián)合缺失、3例bcd區(qū)聯(lián)合缺失、2例abc區(qū)域聯(lián)合缺失、1例abcd區(qū)聯(lián)合缺失)。其中18例表現(xiàn)為無精子癥，2例表現(xiàn)為精子數(shù)目及活力的異常。包括AZFc區(qū)缺失例數(shù)最多，為117例(60例c區(qū)缺失，包括了c區(qū)的聯(lián)合缺失57例，其中 42例cd區(qū)聯(lián)合缺失)，占總例數(shù)的92.1%，其中無精子癥44例，精子數(shù)目及活力異常發(fā)生率最高為63例，精子形態(tài)異常29例，隱匿精子癥8例。包括AZFd區(qū)缺失的共48例(2例d區(qū)缺失，42例cd區(qū)聯(lián)合缺失，3例bcd區(qū)聯(lián)合缺失，1例abcd區(qū)聯(lián)合缺失)，占總例數(shù)的37.8%，其中臨床表型最多見的為精子數(shù)目及活力異常，共35例。

2.3 胚胎情況和妊娠結(jié)局A組共納入131例，其中52例患者行供精人工授精助孕，79例行ICSI助孕(包括14例行供精I(xiàn)CSI)。B組共867例，其中172例患者行人工授精，695例行IVF/ICSI助孕(包括48例行供精I(xiàn)CS)。C組共1 247例，均行IVF/ICSI助孕，且精液來源為男方。

分別比較A組與B組及A組與C組行IVF/ICSI且精液來源為丈夫的周期的胚胎情況及妊娠結(jié)局，見表2。

3 討論

3.1 Y染色體微缺失的發(fā)生率及對精液情況的影響Y染色體微缺失的發(fā)生率由于人種的差異和樣本量的限制，現(xiàn)有的報道差異很大。多數(shù)研究[1-3]表明Y染色體微缺失在不育男性中的發(fā)生率多在15%以下，本研究中Y染色體微缺失發(fā)生率為13.12%。在對一般情況的統(tǒng)計中，Y染色體微缺失組的患者年齡明顯小于輸卵管對照組，這可能由于Y染色體微缺失組的患者均為原發(fā)性不育，發(fā)現(xiàn)癥狀及就診時間較早。在比較各組精液常規(guī)檢查結(jié)果后可知B組、C組的精液密度和精子活力均優(yōu)于A組，而現(xiàn)有研究[4]已經(jīng)證明精液質(zhì)量隨著年齡增長呈下降趨勢。此外，在對已知臨床表型的127例Y染色體微缺失患者進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)， Y染色體微缺失的發(fā)生可能對于精液密度和精子活力有影響。

3.2 Y染色體微缺失的臨床表現(xiàn)在無精子癥與少精子癥患者中，約有8%～10%篩查存在Y染色體微缺失，研究[5]表明無精子癥和少精子癥與Y染色體微缺失存在相關(guān)性。Y染色體微缺失好發(fā)于Y染色體的AZF區(qū)域，該區(qū)域的缺失是目前已知最常見的影響生精功能的致病因素之一。1996年Vogt et al[6]將微缺失映射在Yq11上的3個區(qū)域，分別命名為AZFa、AZFb和AZFc，認(rèn)為他們與精子的不同發(fā)生階段相關(guān)。Kent-First et al[7]于1999年報道了第4個區(qū)域，即AZFd區(qū)的存在。Stouffs et al[8]研究表明AZFa區(qū)的缺失在臨床表型上最不理想，表現(xiàn)為唯支持細(xì)胞綜合征，曲細(xì)精管中完全沒有生殖細(xì)胞，即使行睪丸穿刺也無法獲得精子，無法行ICSI助孕。AZFb區(qū)微缺失表型多為無精子癥至輕度的少弱精子癥，亦可表現(xiàn)為唯支持細(xì)胞綜合征[9]。AZF區(qū)域的微缺失多發(fā)生在AZFc區(qū)[10]，且AZFc區(qū)微缺失的患者臨床表型較為多樣。Hopps et al[11]的研究表明盡管微缺失位于Y染色體的AZFa或AZFb區(qū)域的患者，通過睪丸取精、經(jīng)皮附睪抽吸取精等取精術(shù)后獲得的精子質(zhì)量非常不理想，但大多數(shù)AZFc區(qū)缺失的男性精液中的精子可供進(jìn)行IVF/ICSI助孕。而微缺失發(fā)生于AZFd區(qū)的患者可能出現(xiàn)輕度少精子癥或精子數(shù)目正常但伴有形態(tài)異常。

表1 3組患者一般情況及精液常規(guī)結(jié)果分析

與B組比較：*P<0.05；與C組比較：#P<0.05

表2 3組患者使用的ART類型、胚胎情況及妊娠結(jié)局分析(%)

與B組比較：*P<0.05；與C組比較：#P<0.05

據(jù)微缺失發(fā)生率及臨床表型的統(tǒng)計結(jié)果推斷，在AZF的4個常見的微缺失區(qū)域中，AZFa區(qū)缺失的臨床表型最為嚴(yán)重，AZFb區(qū)的缺失也較易發(fā)生無精子癥，因此，對于AZFa或AZFb區(qū)發(fā)生微缺失的患者避免盲目使用TESE及PESA，臨床上對于該類患者可相應(yīng)考慮AID或供精I(xiàn)CSI助孕，以減少患者不必要的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。AZFc區(qū)及d區(qū)發(fā)生缺失的患者中表現(xiàn)為無精子癥的例數(shù)相對較少，大多為精子數(shù)目和活力的異常，獲得精子的情況下受精率及妊娠率良好，更適宜采取非供精的IVF/ICSI方式助孕。

3.3 Y染色體微缺失患者精液情況及行ART助孕結(jié)局由于Y染色體微缺失常表現(xiàn)為無精子癥及嚴(yán)重少弱精子癥，部分患者選擇AID或供精I(xiàn)CSI助孕，也有一部分患者的精液經(jīng)處理后可選擇ICSI助孕。對行IVF/ICSI且精液來源為丈夫的周期的胚胎情況及妊娠結(jié)局進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，A組的正常受精率高于B組中行IVF助孕的周期及C組的正常受精率，造成這一結(jié)果可能是因為C組男方為正常對照，大多采用IVF助孕，而A組由于男方精子質(zhì)量差均采用ICSI助孕，而由于技術(shù)流程的差異IVF受精率一般略低于ICSI[12]。此外，A組正常受精率低于B組行ICSI助孕的周期的正常受精率，雖這兩組正常受精率均大于60%，但不排除Y染色體微缺失對于正常受精的影響。同時，對優(yōu)質(zhì)胚胎率、妊娠率及流產(chǎn)率進(jìn)行統(tǒng)計的結(jié)果提示了Y染色體微缺失雖然不影響整體妊娠結(jié)局，但對于胚胎后期的正常發(fā)育潛能可能存在負(fù)面影響。

此外，有研究[13-14]報道AZFc區(qū)域缺失患者的精液質(zhì)量會進(jìn)行性下降，且AZF區(qū)的缺失遺傳過程中有擴(kuò)大趨勢并影響子代的生育能力。因此對于這類患者，建議其提前進(jìn)行精液冷凍保存，并通過ICSI方式助孕聯(lián)合胚胎植入前遺傳學(xué)診斷選擇女胚，人為地避免Y染色體微缺失傳遞給男性后代。但由于研究數(shù)量有限，對于Y染色體微缺失患者行ICSI助孕對后代的影響仍需要進(jìn)一步的觀察。

綜上，本研究通過對Y染色體微缺失患者及對照組的臨床診斷、精液質(zhì)量及行ICSI助孕的妊娠結(jié)局等指標(biāo)進(jìn)行分析，為臨床診療中對Y染色體微缺失患者助孕方式的選擇提供參考。