謝蓓蓓，李麗麗，夏瑞祥

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一種發(fā)生在B細胞系或T細胞系的未成熟淋巴細胞或淋巴祖細胞的血液造血系統(tǒng)惡性疾病，在生物學特征、臨床特征及預后等方面具有很大異質(zhì)性，其中T細胞急性淋巴細胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)約占成人ALL的15%[1]。目前對成人T-ALL患者的治療主要采取化療和異基因造血干細胞移植，但總體預后較差，化療抗性為原因之一。該研究通過高通量測序及體外藥敏方法檢測54種白血病相關(guān)基因及81種化療藥物敏感度，尋找耐藥相關(guān)基因，并初步分析該基因臨床特征。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2016年10月～2018年1月就診于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液科的初診T-ALL患者38例，其中男21例，女17例，年齡在16～80(50.50±15.59)歲，中位年齡50歲，所有T-ALL患者診斷及分型均符合張之南 等[2]主編的《血液病診斷及療效標準》。初診治療前抽取外周靜脈血4～8 ml行高通量測序及體外藥敏試驗。成人T-ALL 患者均使用 VDCLP或VICLP方案治療，化療1個療程后復查骨髓判斷療效。

1.2 方法

1.2.1細胞分離及培養(yǎng)方法 Ficoll密度梯度離心法分離樣本，預熱淋巴細胞分離液和細胞培養(yǎng)液RPMI 1640至室溫，將淋巴細胞分離液加入離心管中，取2倍量的Hank′s液或RPMI 1640與肝素抗凝靜脈血充分混勻，疊加于分層液面上，常溫水平離心1 350 r/min、30 min,吸取離心后中間層中單個核細胞，加入5倍體積的Hank′s液或RPMI 1640，1 500 r/min離心10 min，洗滌細胞2次。末次離心后，棄上清液，加入含20%胎牛血清的RPMI 1640，重懸細胞。取重懸的細胞懸液10 μl, 加入80 μl RPMI 1640培養(yǎng)基、10 μl臺盼藍染液充分混合后，死細胞可被染成藍色，活細胞不著色。

1.2.2高通量測序方法 分離提純的單核細胞進行DNA抽提，NanoDrop鑒定純度。DNA與探針混合后加溫至95 ℃、1 min，再讓樣本探針緩慢降溫到40 ℃。除未雜交上的探針，延伸并連接雜交上的探針行PCR擴增。采用AMPure XP 純化PCR完成后的產(chǎn)物并進行質(zhì)控，上機檢測。共檢測54個白血病相關(guān)基因，見表1。

1.2.3體外藥敏試驗方法 按照1×105～1×106個細胞/ml在細胞加樣槽中充分混勻后進行培養(yǎng)，每孔細胞數(shù)目為5×103～5×104/個。分別對每孔加入0.1 μl所測藥物，培養(yǎng)箱中孵育72 h后，加入10 μl CellTiter-Glo 細胞增殖熒光檢測試劑，靜置10 min，Envision Plate-Reader讀數(shù)。藥物名稱見表2。

表1 54種基因檢測列表

表2 81種體外藥物檢測列表

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 23.0進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料中非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示，采用非參數(shù)檢驗，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高通量測序結(jié)果在38例成人T-ALL患者中，NOTCH1突變率最高，NOTCH1突變有18例，占47.3%，總共發(fā)現(xiàn)18個突變，其中13個點突變，4個缺失突變，1個插入突變。在18例NOTCH1陽性患者中，其中14例存在點突變，4例存在缺失突變，1例存在插入突變。余20例患者未發(fā)現(xiàn)NOTCH1突變，見表3。

表3 18例NOTCH1基因突變患者突變類型及突變位點

2.2 體外藥敏結(jié)果對38例患者行88種藥物體外藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，地塞米松耐藥性高，在地塞米松濃度為3.3 μmol/L時，19例患者對地塞米松耐藥，其中NOTCH1陽性者占13例，陰性者占6例，地塞米松濃度為1.1 μmol/L時，21例患者對地塞米松耐藥，其中NOTCH1陽性者占14例，陰性者占7例，地塞米松濃度為0.37 μmol/L時，22例患者對地塞米松耐藥，其中NOTCH1陽性者占16例，陰性者占6例，不同濃度下，NOTCH1突變組與非突變組在地塞米松敏感性兩組結(jié)果之間差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.002、P=0.011、P<0.001)。見表4。38例患者臨床化療方案為長春新堿1.4 mg/m2第1、8、15、22天+柔紅霉素40 mg/(m2·d)第1～3天+環(huán)磷酰胺750 mg/m2第1～3天+左旋門冬酰胺酶6 000 IU/m2第11、14、17、20、23、26天+地塞米松0.15 mg/(kg·d)第1～28天(第15天后逐漸減量)(VDCLP)或長春新堿1.4 mg/m2第1、8、15、22天+去甲氧柔紅霉素8 mg/(m2·d)第1～3天+環(huán)磷酰胺750 mg/m2第1～3天+左旋門冬酰胺酶6 000 IU/m2第11、14、17、20、23、26天+地塞米松0.15 mg/(kg·d)第1～28天(第15天后逐漸減量)(VICLP)，在18例NOTCH1突變組患者中，CR 15例，非CR 113例，20例NOTCH1非突變組患者，CR 116例，非CR 14例，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)。體外藥敏試驗與實際臨床緩解率之間差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 NOTCH1突變與不同濃度地塞米松敏感性相關(guān)性

2.3 NOTCH1突變患者臨床特征18例NOTCH1突變組中，男性9例，女性9例，20例NOTCH1非突變組中，男性12例，女性8例，性別差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.383，P=0.438)，NOTCH1突變組與非突變組的年齡、初診時白細胞計數(shù)、骨髓原始細胞數(shù)、血紅蛋白、LDH水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，血小板計數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

3 討論

成人急性淋巴細胞白血病預后相對較差，對糖皮質(zhì)激素耐藥是引起兒童及成人預后差異的重要原因之一[3]，糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)是T-ALL治療中的重要化療藥物，貫穿于T-ALL治療的整個過程，糖皮質(zhì)激素通過與激素受體(glucoticoid receptor，GR)結(jié)合后進入細胞核內(nèi)，啟動下游凋亡途徑來發(fā)揮誘導白血病細胞凋亡和溶細胞作用[4]，但其耐藥機制目前尚未完全明確。NOTCH1是一種Ⅰ型膜蛋白受體及配體激活型轉(zhuǎn)錄因子，最初認為是以B細胞發(fā)育為代價指導T細胞譜系定型所必需[5]，T細胞惡性腫瘤幾乎都有NOTCH信號通路的活化[6]，如今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了其對T細胞白血病中的致癌潛力[7-8]。在NOTCH1信號傳導途徑中，當配體與其細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合時，NOTCH1跨膜受體被激活，首先引起兩個連續(xù)的蛋白水解切割事件，進而通過激活PI3K-AKT-mTOR通路、NOTCH1-cMYC信號通路、NF-κB通路等導致T-ALL的發(fā)生[9-13]。

表5 NOTCH1突變與各因素相關(guān)性[M(P25，P75)]

為了解NOTCH1突變是否引起化療抗性，本研究對所有患者行體外藥敏試驗，結(jié)果提示18例NOTCH1突變患者對三種不同濃度的地塞米松均表現(xiàn)出耐藥性，0.37 μmol/L時有16例對地塞米松耐藥，1.1 μmol/L時有14例對地塞米松耐藥，3.3 μmol/L時有13例對地塞米松耐藥，由此可見NOTCH1突變可引起對化療藥物地塞米松耐藥。

目前有大量臨床系列研究分析了NOTCH1突變與臨床預后的相關(guān)性，大多數(shù)的研究認為NOTCH1基因突變的T-ALL預后較好，本研究顯示，NOTCH1突變組的18例患者中，有5例獲得CR1，13例未達到CR1，無NOTCH1突變組的20例患者中，有16例獲得CR1，4例未達到CR1，突變組CR1率明顯低于非突變組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示NOTCH1基因突變可能為預后不佳指標。劉卉 等[14]研究顯示， NOTCH1突變組患者2年累積總生存率和無事件生存率低于無突變者，突變組的復發(fā)率高于非突變組，本研究結(jié)果與之相似。

進一步分析NOTCH1突變組的臨床特征可見，NOTCH1突變組和非突變組的年齡、性別、初診時白細胞計數(shù)、骨髓原始細胞數(shù)、血紅蛋白、LDH差異均無統(tǒng)計學意義，血小板計數(shù)差異有統(tǒng)計學意義，NOTCH1突變組患者具有更低的血小板計數(shù)，本研究結(jié)果顯示NOCTH1突變未引起高腫瘤負荷，但可導致血小板計數(shù)降低，可能帶來較大的出血風險。

本研究結(jié)果提示，NOTCH1突變可引起對地塞米松耐藥，引起較差的治療效果，針對該類患者據(jù)體外藥敏結(jié)果行精準醫(yī)療有望改善預后。由于本研究樣本量較少，后期可通過擴大樣本量進一步核實NOTCH1突變與地塞米松耐藥之間相關(guān)性，并建立動物模型了解耐藥發(fā)生機制，尋找阻斷耐藥方法。