楊 琪，卓少元

肝癌是目前臨床常見(jiàn)難治的惡性腫瘤，其國(guó)內(nèi)發(fā)病率與死亡率分別位居惡性腫瘤第四位和第二位[1]。肝癌發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，但促進(jìn)腫瘤的炎癥是目前公認(rèn)的腫瘤十大特征之一[2]，慢性肝臟炎癥在肝癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有至關(guān)重要的推動(dòng)作用[3-4]。Caspase-1是第一個(gè)在哺乳動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)的半胱氨酸-天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteine containing aspartate specific protease, Caspase)，其在多種炎癥反應(yīng)中具有核心調(diào)控作用[5]。該研究采用腹腔注射二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)的方式來(lái)誘導(dǎo)大鼠肝炎-肝硬化-肝癌模型，旨在探討Caspase-1及其相關(guān)炎癥因子白細(xì)胞介素 1β (interleukin-1β, IL-1β)、IL-18、核因子-κB (nuclear factor κB, NF-κB)在DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌形成過(guò)程中的變化及意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠 42 只，SPF級(jí)，體質(zhì)量(140±20)g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK桂2014-0002，使用許可證號(hào)SYXK桂2014-0003。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑DEN購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)N0756-10ML；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase, AST)測(cè)定試劑盒購(gòu)自長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為C002-a、C001-a；α-L-巖藻糖苷酶(α-L-fucosidase, AFU)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transpeptidase, GGT)測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，貨號(hào)分別為E008、C017；大鼠Caspase-1活性測(cè)定試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)BC3810；大鼠IL-1β、IL-18和NF-κB酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)分別為E-EL-R0012c、E-EL-R2426c、E-EL-R0674c。

1.3 主要儀器Chemray全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自美國(guó)Rayto公司；Epoch Biotek全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotek公司；DMI3000B研究型倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司；ST 16R高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Sorvall Scientific公司。

1.4 方法

1.4.1動(dòng)物造模 實(shí)驗(yàn)大鼠共42只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后(溫度為21～23 ℃，濕度50%)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(6只)和模型組(36只)，其中模型組按照70 mg/kg體質(zhì)量給予腹腔注射DEN，每周1次，連續(xù)注射10周。

1.4.2標(biāo)本采集及處理 造模第 0 周隨機(jī)抽取正常組動(dòng)物3只，及造模第6、13、20周最后1天隨機(jī)抽取模型組動(dòng)物3只，分別用3%戊巴比妥腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，常規(guī)制備血清并分裝后于-80 ℃ 保存?zhèn)溆?。之后迅速取其完整肝臟、脾臟和胸腺組織標(biāo)本，計(jì)算肝、脾和胸腺指數(shù)：臟器指數(shù)(%)=臟器濕重(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.4.3肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察 在各組大鼠肝臟同一部位取組織一塊，4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，切片脫蠟，HE染色，脫水封片，光鏡下觀察。

1.4.4血清指標(biāo)檢測(cè) 采用可見(jiàn)分光光度法檢測(cè)各組大鼠血清中ALT、AST、GGT和AFU的含量；采用ELISA法檢測(cè)血清炎癥因子IL-1β、IL-18和NF-κB水平。以上步驟均嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.5肝臟(或肝癌)組織Caspase-1活性檢測(cè) 組織加裂解液勻漿后離心取上清液，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，使蛋白濃度達(dá)到1～3 mg/ml。按照Caspase-1活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，于405 nm波長(zhǎng)檢測(cè)光密度(optical density，OD)值，計(jì)算Caspase-1活性，Caspase-1活性百分比=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較模型組大鼠在造模前期，進(jìn)食進(jìn)水量和正常組相差不大，從造模第5周開(kāi)始進(jìn)食進(jìn)水量都明顯下降，精神萎靡活動(dòng)量減少，且開(kāi)始暴躁；第9周開(kāi)始有大鼠死亡，至造模結(jié)束共有7只大鼠死亡，解剖發(fā)現(xiàn)腹腔積水且胃腸道透明，其余大鼠在第20周均已致癌。正常組(第0周)大鼠肝臟形態(tài)正常，顏色鮮紅，質(zhì)地柔軟，表面光滑無(wú)任何異常，見(jiàn)圖1A；造模第6周大鼠肝臟與第0周比較，除顏色稍深之外，無(wú)明顯的異常表現(xiàn)，見(jiàn)圖1B；造模第13周大鼠肝臟表面逐漸粗糙，出現(xiàn)數(shù)量不等、大小不一的灰白色近圓形病灶，直徑大多1 mm以下，呈彌散分布，見(jiàn)圖1C；造模20周時(shí)，大鼠肝臟表面非常粗糙，出現(xiàn)多個(gè)大小不一的灰白色結(jié)節(jié)，部分大鼠腹腔有黃色腹水，肝臟與周?chē)鞴兖みB嚴(yán)重，可見(jiàn)出血和壞死，見(jiàn)圖1D。在造模過(guò)程中，大鼠體質(zhì)量呈逐漸上升趨勢(shì)。與正常組(第0周)大鼠比較，造模第6周大鼠肝臟、脾臟和胸腺指數(shù)均下降；隨著造模進(jìn)程，肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)逐漸增加；而胸腺指數(shù)逐漸下降，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明DEN對(duì)臟器具有一定的毒性，大鼠免疫功能被抑制。見(jiàn)表1。

圖1 DEN誘導(dǎo)癌過(guò)程中大鼠肝臟形態(tài)變化

時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量(g)肝臟指數(shù)脾臟指數(shù)胸腺指數(shù)第0周163±16296.69±9.2532.39±4.9120.12±10.37第6周338±27271.07±8.6417.66±2.6810.15±6.23第13周420±39388.26±12.1227.12±4.096.67±4.76第20周428±44552.65±17.41**43.53±6.613.06±2.18**

與第0周比較：**P<0.01

2.2 肝臟組織病理學(xué)比較正常組(第0周)大鼠肝細(xì)胞完整，在肝小葉中央靜脈周?chē)史派錉钆帕?。造模?周大鼠肝細(xì)胞腫脹，表現(xiàn)為彌漫性肝細(xì)胞水腫，部分肝細(xì)胞呈嗜酸性變；肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整，小葉內(nèi)可見(jiàn)灶性壞死伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。造模第13周大鼠肝細(xì)胞水腫進(jìn)一步加重，可見(jiàn)不同程度的小泡性脂肪變性；出現(xiàn)嗜酸性或透明細(xì)胞增生灶，可見(jiàn)典型假小葉形成。造模第20周大鼠肝細(xì)胞可見(jiàn)不同程度的脂肪變性，肝癌細(xì)胞成團(tuán)塊狀，部分有出血和壞死，并伴有肝細(xì)胞增生灶和結(jié)節(jié)。見(jiàn)圖2。

2.3 大鼠血清生化指標(biāo)含量變化血清ALT、AST、GGT、AFU的含量均隨著造模進(jìn)程逐漸升高。與正常組(第0周)比較，血清ALT、AST和GGT含量在造模第13周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，第20周表現(xiàn)則更加明顯；血清AFU含量在造模第20周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。提示大鼠肝功能在造模過(guò)程中逐漸惡化。

2.4 大鼠血清IL-1β、IL-18和NF-κB含量變化血清IL-1β、IL-18和NF-κB含量均隨著造模進(jìn)程逐漸升高。與正常組(第 0 周)比較，造模第 6 周大鼠血清IL-1β含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，NF-κB含量升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模第13周大鼠血清IL-1β、NF-κB含量明顯升高(P<0.01)；造模第20周鼠血清IL-1β、IL-18和NF-κB含量最高(P<0.01)。見(jiàn)表3。

2.5 大鼠肝臟(或肝癌)組織中Caspase-1活性變化大鼠肝臟組織中Caspase-1活性隨著造模進(jìn)程逐漸升高。與正常組(第0周)比較，造模第6周大鼠肝組織中Caspase-1活性升高(P<0.05)，造模第13周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，至造模第20周活性達(dá)到最高(P<0.01)。造模第 20 周時(shí)，與大鼠肝臟(含肝癌)組織比較，癌旁正常肝組織中Caspase-1活性幾乎沒(méi)有差別；但肝癌組織內(nèi)Caspase-1活性卻顯著降低，甚至低于造模第6周的肝組織。見(jiàn)表4。

表2 造模不同時(shí)期大鼠血清生化指標(biāo)含量變化

與第0周比較：*P<0.05，**P<0.01

表3 大鼠血清中IL-1β、IL-18和NF-κB含量變化

與第0周比較：*P<0.05，**P<0.01

圖2 造模不同時(shí)期大鼠肝臟組織病理學(xué)比較

表4 大鼠肝臟組織中Caspase-1活性變化

與第0周比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

人類(lèi)原發(fā)性肝癌的發(fā)生是一個(gè)多種誘因、多階段的過(guò)程，要經(jīng)歷肝炎-肝硬化-肝癌的過(guò)程。而現(xiàn)代研究證實(shí)，DEN是一種具有遺傳毒性的化學(xué)物質(zhì)，具有肝毒性，可致基因突變、畸形，還可誘導(dǎo)肺、肝、血液系統(tǒng)多種腫瘤的形成，應(yīng)用DEN制作肝癌前病變模型具有階段性特征。湯靚[6]的研究表明DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌模型有明顯的三個(gè)病程：炎癥期(1～8周)、硬化期(9～15周)及肝癌期(16～20周)，與人類(lèi)原發(fā)性肝癌的發(fā)展過(guò)程及病理形態(tài)學(xué)變化等均非常相似。通過(guò)一般觀察、肝臟組織病理學(xué)比較，以及血清生化指標(biāo)分析等結(jié)果，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了該肝癌模型。

本研究分別選取了第0周(正常)、第 6 周(炎癥期)、第13周(硬化期)和第20周(肝癌期)進(jìn)行相關(guān)炎癥因子研究。結(jié)果顯示，血清IL-1β、IL-18、NF-κB含量均隨著造模進(jìn)程逐漸升高，且在造模第20周(肝癌期)達(dá)到最高，提示這些炎癥因子在DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌形成過(guò)程中可能發(fā)揮著非常重要的作用，可作為反映DEN誘導(dǎo)肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程肝細(xì)胞損傷程度的標(biāo)志因子。

IL-1β和IL-18在細(xì)胞內(nèi)主要由Caspase-1切割白細(xì)胞介素1β前體(precursor of interleukin-1β，pro-IL-1β)和pro-IL-18產(chǎn)生；當(dāng)危險(xiǎn)信號(hào)來(lái)臨時(shí)，pro-Caspase-1通過(guò)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白1(nucleotide binging and oligomerization domain-like receptors 1，NLRP1)、NLRP3和黑色素瘤缺乏因子等多種炎性小體感受器蛋白，及銜接分子凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)的作用被激活，成為pro-IL-1β和pro-IL-18成熟的工具酶[5]。NF-κB是炎癥致癌過(guò)程中主要的調(diào)節(jié)因子，研究[7]表明NF-κB在原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)增強(qiáng)，且與癌組織的分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者甲胎蛋白水平等呈正相關(guān)。除此之外，pro-Caspase-1可以利用其半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域直接與受體相互作用蛋白2(receptor-interacting protein 2，RIP2)相互作用，誘導(dǎo)RIP2依賴(lài)的NF-κB激活；與pro-IL-1β、pro-IL-18成熟不同，NF-κB的激活不需要依賴(lài)Caspase-1酶的裂解活性[8]，而且活化后的IL-1還可利用其受體IL-1R1激活NF-κB[9]。這表明IL-1β、IL-18和NF-κB均可作為Caspase-1的效應(yīng)分子在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究也證實(shí)大鼠肝臟組織中Caspase-1活性隨著造模進(jìn)程逐漸升高，其表達(dá)趨勢(shì)與血清IL-1β、IL-18、NF-κB含量一致。

值得注意的是，造模第20周肝癌形成后，Caspase-1活性在大鼠肝臟(含肝癌)組織和癌旁正常肝組織中幾乎沒(méi)有差別，但在肝癌組織內(nèi)卻顯著降低，甚至低于造模第 6 周的肝組織，提示造模第20周大鼠肝臟(含肝癌)組織中Caspase-1活性主要源于癌旁正常肝組織。這一結(jié)果與Wei et al[10]對(duì)臨床肝炎、肝硬化、肝癌患者的研究類(lèi)似：Caspase-1及其相關(guān)炎性小體組分在正常肝組織表達(dá)水平相對(duì)較低，肝損傷(如肝炎、肝硬化)時(shí)表達(dá)量明顯上調(diào)；與癌旁正常肝組織相比，其在肝癌實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào)。其原因可能在于：在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，一方面，以Caspase-1為核心的炎性小體在細(xì)胞內(nèi)激活，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡以消除有癌變傾向的細(xì)胞；另一方面，炎性小體效應(yīng)分子IL-1β、IL-18等的裂解與釋放可能在腫瘤微環(huán)境中引發(fā)炎癥循環(huán)，導(dǎo)致無(wú)菌性炎癥和癌癥發(fā)生[5,11]。

劉錢(qián)[12]的研究也表明當(dāng)肝臟存在炎癥時(shí)，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Caspase-1的表達(dá)會(huì)增強(qiáng)；但在相同條件下，Caspase-1在肝癌細(xì)胞內(nèi)的上調(diào)水平要明顯高于正常肝細(xì)胞。Caspase-1作為一種重要的炎癥相關(guān)分子，可以通過(guò)多種方式參與腫瘤炎癥微環(huán)境調(diào)控，其在腫瘤中的作用正如Zitvogel et al[11]所述：“在惡性腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境相互作用過(guò)程中，Caspase-1的激活扮演著雙面角色：積極誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性死亡和抗腫瘤的免疫監(jiān)視，但同時(shí)也通過(guò)刺激自分泌或旁分泌，促進(jìn)致癌性炎癥及腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移”。