杜 剛，陳 娜，劉曉艷，趙 亮

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)又稱退行性關(guān)節(jié)炎或退行性骨關(guān)節(jié)病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬及活動(dòng)受限等癥狀[1]。全世界范圍內(nèi)，OA發(fā)病率約為15%，在中老年慢性疾病中位列第2位[2]。軟骨細(xì)胞數(shù)目及穩(wěn)定的功能對于維持軟骨穩(wěn)態(tài)、軟骨基質(zhì)合成和降解平衡有著至關(guān)重要的作用。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是一種高選擇性受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等多種功效[3]，研究[4]表明Dex還具有抗炎作用。紅景天苷(salidroside，Sal)是紅景天的主要活性成分，已有研究[5-6]報(bào)道Sal對缺血缺氧心肌以及神經(jīng)元具有一定保護(hù)作用，Sal作用機(jī)制與減輕興奮性毒性、拮抗鈣超載及清除細(xì)胞內(nèi)活性氧基團(tuán)或分子(reactive oxygen species，ROS)等相關(guān)。該研究主要探討Sal和Dex聯(lián)合用藥在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)模型中對軟骨細(xì)胞的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清和胰酶均購自美國Gibco公司；赫斯特(Hoechst)染色 3342染色試劑盒(貨號：ab228551)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cysteinylaspartatespecificproteinase-9，Caspase-9)(貨號：ab32539)、Caspase-3(貨號：ab13847)、BrdU(貨號：ab8955)、二型膠原蛋白(denatured type II collagen，Collagen II)(貨號：ab34712)、聚集蛋白聚糖(貨號：ab3778)、MMP-13(貨號：ab39012)、p65(貨號：ab16502)、p-p65(貨號：ab6503)、GAPDH(貨號：1056)一抗均購自美國abcam公司； LPS(貨號：L2630)購自美國sigma公司；，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司；ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；白介素6(interleukin-6，IL-6)(貨號：E-EL-R0015c)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)(貨號：E-AB-10698)、IL-1β(貨號：E-EL-M0037c)購自上海博耀有限責(zé)任公司。

1.2 儀器PCR儀、電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀均購自美國伯樂公司；Gel View 6000化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自廣州云星儀器有限公司。Multiskan GO酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1分離人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞 手術(shù)室無菌條件下，獲取因外傷進(jìn)行關(guān)節(jié)置換患者軟骨組織(獲得知情同意)，先后使用0.2%胰蛋白酶、0.2% Ⅱ型膠原酶低糖DMEM溶液、0.2%Ⅱ型膠原酶溶液消化30 min，再加入DMEM培養(yǎng)基(含20%胎牛血清、鏈霉素100 u/ml、青霉素100 u/ml)制成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，再置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一般4～6 h后軟骨組織塊消化完全。觀察細(xì)胞生長情況，每3 d換液。

1.3.2LPS誘導(dǎo)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞關(guān)節(jié)炎及聯(lián)合用藥分組 取傳代3次的人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，分別設(shè)置健康對照組(Ctrl組)、LPS誘導(dǎo)模型組(LPS組)、單用Sal組(LPS+Sal組)、單用Dex組(LPS+Dex組)、Dex聯(lián)合Sal組(LPS+Dex+Sal組)。各組模型中LPS刺激8 h(100 ng/ml)，Sal(50 μg/ml)和Dex(100 nmol/l)連續(xù)使用48 h。收集細(xì)胞備用。

1.3.3Hoechst染色 對藥物處理的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后進(jìn)行染色處理：吸盡培養(yǎng)液后加入0.5 ml固定液固定10 min；去除固定液用PBS洗2次，每次3 min；加入0.5 ml Hoechst染色液染色5 min；用PBS洗2次，每次3 min；滴加抗熒光淬滅封片液蓋上蓋玻片熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4免疫熒光染色 操作步驟按照說明書進(jìn)行，細(xì)胞接種于預(yù)先用0.01%多聚賴氨酸包被的蓋玻片，經(jīng)藥物處理后，進(jìn)入4%多聚甲醛固定30 min。PBS漂洗，用含Triton X-100封閉液在冰上通透5 min；吸掉通透液，加入預(yù)溫的封閉液，室溫下封閉1 h；孵育一抗4 ℃過夜。次日，PBS漂洗，孵育熒光標(biāo)記的二抗(濃度為1 ∶200)，室溫避光孵育1 h，PBS漂洗，50%甘油-指甲油封片，立即避光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.55-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)檢測細(xì)胞增殖 取處理后各組軟骨細(xì)胞對6孔細(xì)胞板進(jìn)行鋪板，1×105個(gè)/孔。加入BrdU，37 ℃孵育40 min；棄培養(yǎng)液，培養(yǎng)板用PBS洗滌3次，甲醇固定10 min；經(jīng)過空氣干燥，0.3% H2O2-甲醇30 min滅活內(nèi)源性氧化酶；5%正常兔血清封閉，甲酰胺100 ℃、5 min變性核酸；冰浴冷卻后PBS洗滌，加一抗即抗小鼠BrdU單抗(工作濃度1 ∶50)，陰性對照加PBS，Hoechst襯染，在顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，進(jìn)行參數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.3.6Western blot檢測細(xì)胞中蛋白表達(dá) 收集4組細(xì)胞，PBS清洗3次，用添加蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，10% SDS-PAGE分離蛋白后用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗于4 ℃封閉過夜，第2天加入對應(yīng)二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL曝光顯影。SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)5% BSA封閉后依次孵育相應(yīng)一抗和二抗。顯色并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對表達(dá)量。

1.3.7ELISA檢測炎癥因子 取各組細(xì)胞上清液低溫4 000 r/min離心8 min，取出上清液供實(shí)驗(yàn)使用。加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50 μl，待測樣品孔先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl。溫育：用封板膜封板后置于37 ℃溫育30 min。配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋30倍后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl，空白孔除外。溫育：再次用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。洗滌：再次小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min。終止：每孔加入50 μl終止液，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)為黃色)。測定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光值(optical density，OD)。測定在加終止液后15 min內(nèi)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 Sal聯(lián)合Dex抑制人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡水平Hoechst染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ctrl組軟骨細(xì)胞著色較淺、均勻分布，細(xì)胞形態(tài)均一；與Ctrl組比較，LPS組軟骨細(xì)胞核著色較深，數(shù)量增多(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+Sal組和LPS+Dex組軟骨細(xì)胞核著色深度有所降低，數(shù)量減少(P<0.01)；與LPS+Dex組比較，LPS+Sal+Dex組軟骨細(xì)胞核著色顯著降低，數(shù)量明顯減少(P<0.01)，見圖1。對各組樣品進(jìn)行Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與Ctrl組比較，LPS組Caspase-3和Caspase-9表達(dá)量顯著增高(P<0.01)；

圖1 不同處理組軟骨細(xì)胞凋亡情況

A：Hoechst染色鑒定細(xì)胞凋亡情況×400；B：不同處理組細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)分析；與Ctrl組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01；與LPS+Dex組比較：△△P<0.01

與LPS組比較，LPS+Sal組和LPS+Dex組Caspase-3和Caspase-9表達(dá)量明顯減少(P<0.01)；與LPS+Dex組比較，LPS+Sal+Dex組Caspase-3和Caspase-9表達(dá)量則顯著降低(P<0.01)，見圖2。

圖2 Western blot檢測不同處理組細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9表達(dá)水平

與Ctrl組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01；與LPS+Dex組比較：△△P<0.01

2.2 Sal聯(lián)合Dex促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖BrdU染色實(shí)驗(yàn)顯示，Ctrl組軟骨細(xì)胞著色數(shù)量較多；與Ctrl組比較，LPS組軟骨細(xì)胞著色數(shù)量顯著減少(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+Sal組和LPS+Dex組軟骨細(xì)胞著色數(shù)量有所增加(P<0.01)；與LPS+Dex組比較，LPS+Sal+De組軟骨細(xì)胞著色數(shù)量增加顯著(P<0.01)。見圖3。

2.3 Sal聯(lián)合Dex促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌功能蛋白Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，與Ctrl組比較，LPS組軟骨細(xì)胞分泌Collagen Ⅱ和軟骨蛋白聚糖水平顯著降低，基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinases-13，MMP-13)表達(dá)能力顯著上升(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+Sal組和LPS+Dex組軟骨細(xì)胞分泌Collagen Ⅱ和軟骨蛋白聚糖水平有所提高，MMP-13表達(dá)量有所下降(P<0.01)；與LPS+Dex組比較，LPS+Sal+De組軟骨細(xì)胞分泌Collagen Ⅱ和軟骨蛋白聚糖水平顯著升高，分泌MMP-13能力顯著下調(diào)(P<0.01)。見圖4。

2.4 Sal聯(lián)合Dex降低軟骨細(xì)胞分泌炎癥因子ELISA檢測細(xì)胞樣本中相關(guān)炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β結(jié)果顯示，與Ctrl組比較，LPS組軟骨細(xì)胞分泌炎癥因子水平顯著增強(qiáng)(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+Sal組和LPS+Dex組軟骨細(xì)胞分泌炎癥因子水平有所下降(P<0.01)；與LPS+Dex組比較，LPS+Sal+Dex組軟骨細(xì)胞分泌炎癥因子能力顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖5。

2.5 Sal聯(lián)合Dex抑制軟骨細(xì)胞中NF-κB p65信號活性為了進(jìn)一步探究Sal對Dex在人軟骨細(xì)胞炎癥中的調(diào)節(jié)作用，通過免疫熒光技術(shù)檢測不同處理組細(xì)胞中p65入核情況(使用Hoechst對軟骨細(xì)胞進(jìn)行背景染色)，與Ctrl組比較，LPS組軟骨細(xì)胞核幾乎全部為陽性(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+Sal組和LPS+Dex組軟骨細(xì)胞核陽性率有所下降(P<0.01)；與LPS+Dex組比較，LPS+Sal+Dex組軟骨細(xì)胞核陽性率顯著下降(P<0.01)，見圖6。同時(shí)，使用Western blot對各組軟骨細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因κB p65(nuclear transcription factor κB p65，NF-κB p65)激活清況進(jìn)行檢測。與Ctrl組比較，LPS組軟骨細(xì)胞NF-κB p65激活水平顯著升高(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+Sal組和LPS+Dex組軟骨細(xì)胞中NF-κB p65激活情況有所下降(P<0.01)；與LPS+Dex組比較，LPS+Sal+Dex組軟骨細(xì)胞中NF-κB p65活性顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖7。

圖3 BrdU染色檢測軟骨細(xì)胞增殖×400

與Ctrl組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01；與LPS+Dex組比較：△△P<0.01

圖4 Western blot檢測顯示軟骨細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平

與Ctrl組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01；與LPS+Dex組比較：△△P<0.01

圖5 ELISA法檢測軟骨細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)水平

與Ctrl組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01；與LPS+Dex組比較：△△P<0.01

3 討論

我國傳統(tǒng)藏藥紅景天富含Sal，具有抗衰老、抗氧化應(yīng)激等藥理作用。Dex除了具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用外，同時(shí)還可以通過激活膽堿能抗炎通路，使單核/巨噬細(xì)胞TNF-α等炎癥因子的合成、釋放明顯減少，從而抑制全身過度炎癥反應(yīng)[7]。Luo et al[8]研究證實(shí)，在非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系中，Dex可以通過降低C/EBP同源蛋白信號通路的活性來抑制凋亡的發(fā)生；而Wang et al[9]同樣在A549細(xì)胞中證明Dex可以通過α2-腎上腺素能受體來激活抗凋亡的通路，抑制凋亡的發(fā)生。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道稱OA軟骨氧濃度明顯低于正常軟骨，低氧環(huán)境又促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子-1α( hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)表達(dá)水平上調(diào)[10]。HIF-1α可以激活TGF-β1分子[11]以活化纖維蛋白溶酶原(plasminogen activator, PA)來減少膠原蛋白合成；通過PA誘導(dǎo)TNF-α上調(diào)，激活下游Caspase-3和MMP-13通路[12]；上調(diào)MMP抑制因子1表達(dá)從而降解下游靶蛋白以減少軟骨細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白合成[13]。本研究結(jié)果證明，LPS誘導(dǎo)的人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子IL-6、TNF-α等。對LPS+Dex組軟骨細(xì)胞進(jìn)行Sal聯(lián)合Dex處理后，細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6和IL-1β等減少，并且細(xì)胞內(nèi)Caspase-3和Caspase-9都發(fā)生明顯降低，并且還促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖比例。同時(shí)也檢測到Collagen Ⅱ和Aggrecan蛋白分泌增加，MMP-13分泌顯著下調(diào)。表明Sal可以促進(jìn)Dex對軟骨細(xì)胞功能改善，可以有效抑制軟骨細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可以促進(jìn)細(xì)胞增殖速率。

圖6 各處理NF-κB p65表達(dá)定位及活性

A：免疫熒光檢測各處理組NF-κB p65表達(dá)定位及活性×400；B：免疫熒光檢測各處理組NF-κB p65表達(dá)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析；與Ctrl組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01；與LPS+Dex組比較：△△P<0.01

圖7 Western blot檢測各處理組NF-κB p65表達(dá)水平

與Ctrl組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01；與LPS+Dex組比較：△△P<0.01

TGF-β信號分子在多種重要信號途徑中參與多細(xì)胞應(yīng)答，如細(xì)胞增殖、分裂、凋亡、免疫及驗(yàn)證應(yīng)答等[14]。TGF-β1一方面降低p-NF-κB p65和TNF-α活性來降低炎癥因子IL-6、IL-17等來抑制免疫炎癥[15]，另一方面還可以結(jié)合TNF-α共同抑制Caspase-3依賴的凋亡通路來抑制凋亡發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常組軟骨細(xì)胞p-p65和TNF-α表達(dá)水平較低，且p-NF-κB p65極少入核；經(jīng)過LPS誘導(dǎo)之后兩者水平顯著升高，p-NF-κB p65大量進(jìn)入細(xì)胞核，Dex雖然可以有效降低二者表達(dá)水平，但是在經(jīng)過Sal處理后細(xì)胞p-NF-κB p65和TNF-α等表達(dá)水平進(jìn)一步降低，p-NF-κB p65入核現(xiàn)象也得到明顯改善。說明Sal可以有效促進(jìn)Dex對細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65激活，并且進(jìn)一步影響下游相關(guān)基因的表達(dá)。