張 洋，李維清，王 燕,3,4，毛龍毅，周穎琛，員海超，桂耀庭,3，李賢新,5，歐龍華，史本濤

腎癌(renal cell carcinoma，RCC)是全球范圍內(nèi)十分常見的腫瘤之一，發(fā)病率占所有惡性腫瘤的3%～4%[1]，約占腎臟惡性腫瘤的90%[2]，每年超過20萬例新發(fā)病例及10萬例死亡病例，嚴重影響人類健康[3-4]。有研究[5]認為RCC的發(fā)生與遺傳因素及環(huán)境因素相關(guān)，但是RCC發(fā)生發(fā)展的分子機制尚不清楚。人類FAM64A基因(磷脂酰肌醇結(jié)合網(wǎng)格蛋白相互作用有絲分裂調(diào)節(jié)因子，phosphatidylinositol binding clathrin assembly protein interacting mitotic regulator，又名RCS1或CATS)，最初研究[6]顯示FAM64A基因在小鼠胚胎時期的心肌細胞中高表達，并證明FAM64A作為有絲分裂的調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)細胞周期；研究[7]表明FAM64A與細胞增殖密切相關(guān)，可能作為一個新的細胞增殖標志物。僅有一篇文獻[8]報道FAM64A在多種腫瘤組織中高表達，但其作用機制尚不明確。對FAM64A在RCC發(fā)生發(fā)展的機制研究可為今后尋找RCC分子標志物和基因治療靶點提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例資料本研究選取的15 例RCC及其配對癌旁正常組織標本皆來源于選擇2013年1月～2015年12月收治于北京大學(xué)深圳醫(yī)院泌尿外科的RCC患者。收集的新鮮組織標本離體后立即加入RNA 穩(wěn)定劑以防止RNA降解，隨后用液氮冷凍運輸，并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。所收集的標本均獲得患者知情同意，并經(jīng)過所在醫(yī)院和北京大學(xué)深圳醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準。每例RCC組織及其配對癌旁正常組織標本均被術(shù)后病理證實，正常組織距離癌組織至少5 cm，患者臨床病理資料不完整。

1.2 前期轉(zhuǎn)錄組測序和篩選本研究前期測序由深圳華大基因公司通過Illumina Hiseq 2000測序儀完成，采用第二代高通量測序的方法篩選在RCC組織及其癌旁正常組織中差異表達的 mRNA，因 FAM64A 在RCC組織中的表達量較低，且目前在泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中未有相關(guān)研究報道，故選其作為研究對象。

1.3 組織總RNA的提取從-80 ℃冰箱中隨機選取15例RCC及其配對癌旁正常組織，加入液氮進行碾磨，并根據(jù)產(chǎn)品說明書操作步驟加入TRIzol(購自美國Invitrogen公司)試劑提取研磨后組織中的總RNA，然后通過NanoDrop 2000c紫外分光光度計測定提取組織的總RNA濃度。

1.4 RNA提取和RT-qPCR檢測采用TRIzol裂解細胞，通過氯仿抽提異丙醇沉淀總RNA后，使用Nanodrop-2000紫外分光光度計(美國Thermo Scientific公司)測定RNA濃度。按照 PrimeScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書要求(日本TaKaRa公司)，取1 μg RNA，去除基因組DNA后配制反轉(zhuǎn)錄體系，使用普通PCR儀完成反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA為模板，按照SYBR ? Premix Ex TaqTM試劑盒(日本Takara公司)要求配制反應(yīng)體系，使用熒光定量PCR儀LC480(美國Roche公司)進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，檢測FAM64A在RCC組織和RCC細胞中的表達情況。FAM64A上游引物：5′-CCTGAGAGTGTCTTGGGAG-3′，下游引物：5′-ACAGTGGGTGAGTGACTCTG-3′；以 GAPDH 作為內(nèi)參進行標準化處理(上游引物：5′-CCACTCCTCCACCTTTGACG-3′，下游引物：5′-CTGGTGGTCCAGGGGTCTTA-3′)。

1.5 細胞培養(yǎng)人RCC細胞系A(chǔ)CHN、人胚腎細胞HEK-293和人腎近曲小管上皮細胞系HK-2采用MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，786-0、769-P采用1640培養(yǎng)基，Caki-1和Caki-2細胞采用McCoy′s 5A培養(yǎng)基，均加入10%的胎牛血清、100 U/ml的青鏈霉素、1×GlutaMAX，置于含有5%CO2的37 ℃恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞密度達到70%～90%時，用含有EDTA的胰蛋白酶消化細胞進行傳代，每隔1～2 d換一次細胞培養(yǎng)基。

1.6Westernblot使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠置于TRIs-Glycine SDS 電泳緩沖液電泳分離(SDS-PAGE)。將分離后蛋白置于TRIs-Glycine轉(zhuǎn)膜緩沖液，使用0.2 mm PVDF(美國密理博公司)以330 mA電流轉(zhuǎn)膜60 min。轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中室溫下孵育1 h，然后用FAM64A一抗(美國賽默飛公司，貨號#PA5-62098，稀釋濃度0.4 μg/ml)，細胞周期素B1(Cyclin B1)一抗(美國CST公司，貨號#12231，稀釋比例1 ∶1 000)，β-tubulin一抗(英國Abcam公司，貨號ab52623，稀釋比例1 ∶5 000)于4 ℃孵育過夜。二抗(Anti-rabbit IgG，美國CST公司，貨號#7074，稀釋比例1 ∶1 000)室溫孵育1 h，發(fā)光液 (美國密理博公司)1 ∶1混勻。

1.7 CCK-8檢測細胞增殖能力在96孔板中接種細胞至 70%～90%密度，轉(zhuǎn)染FAM64A-siRNA組和正常對照組、過表達FAM64A組和正常對照組，每孔加入細胞計數(shù)試劑(cell counting kit-8，CCK-8，日本東仁化學(xué)公司)反應(yīng)液10 μl，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，使用酶標儀測量450 nm處吸光度，設(shè)置 0、24、48、72 h 時間梯度分析不同時間點細胞數(shù)量，各實驗組設(shè)置5個復(fù)孔。

1.8 細胞周期同步化(胸腺嘧啶核苷雙阻斷法)取相同生長基數(shù)的細胞培養(yǎng)，將正常生長細胞的培養(yǎng)基換為含2 mmol/L胸腺嘧啶核苷的新鮮培養(yǎng)基，阻斷26 h后所有的細胞均停止在G1/S期，加入含1 mmol/L胞苷的新鮮培養(yǎng)基開始釋放，后每2 h收取一次細胞提取蛋白，得到的蛋白樣為細胞周期同步化后由G1/S期開始不同時間點的細胞。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理RT-qPCR實驗中，采用GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù) RT-qPCR反應(yīng)后得到的各樣本Ct 值，采用2-ΔΔCt法(ΔCt=Ct FAM64A-Ct GAPDH，ΔΔCt=ΔCt tumor-ΔCt normal )進行計算。采用Graphpad prism統(tǒng)計軟件進行分析，用t檢驗比較FAM64A在腎癌及癌旁組織中的表達量，四格法χ2檢驗比較FAM64A的表達量與臨床病理特征之間有無統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAM64A在腎癌組織和腎癌細胞系中的高表達為驗證FAM64A在RCC組織中的表達是否與前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相一致，通過RT-qPCR方法檢測FAM64A在15例RCC組織及其配對癌旁正常組織中FAM64A的表達水平。結(jié)果顯示：15例RCC組織中有12例FAM64A表達水平高于其配對癌旁組織，見圖1A；并且RCC組織中FAM64A的mRNA水平明顯高于其對應(yīng)的癌旁組織(P<0.05)，見圖1B，這與前期測序結(jié)果一致。另外通過比較人腎近曲小管永生化細胞(HK-2)和人腎細胞腺癌細胞(ACHN)、人腎透明細胞癌皮膚轉(zhuǎn)移細胞(Caki-1)、人腎透明細胞癌細胞(Caki-2)、人腎透明細胞腺癌細胞(786-O)、人腎癌細胞(769-P)的FAM64A mRNA水平后發(fā)現(xiàn)，腎癌細胞系中FAM64A mRNA表達水平均明顯高于HK-2，見圖1C，其中在RCC細胞系786-O和Caki-2中FAM64A的表達水平相對較高，其次是ACHN、769-P和Caki-1。上述結(jié)果提示FAM64A在RCC組織和細胞系中高表達可能與RCC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

2.2 不同分期RCC患者FAM64A的表達水平通過腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫篩選510例RCC患者，將所有樣本按照RCC組織中FAM64A表達量的平均值為界分為低表達組和高表達組。按照50歲將所有樣本分為2組，同時與性別、TNM分期和愈后5年存活率列出四格表，進行χ2檢驗分析各組間FAM64A表達水平差異。結(jié)果顯示不同性別、TNM分期、愈后5年存活率之間的FAM64A表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，但不同年齡段之間FAM64A的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。510例RCC患者根據(jù)FAM64A表達量及愈后時間繪制生存分析，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)AM64A高表達組RCC患者的預(yù)后生存率明顯降低。見圖2。

圖1 FAM64A在腎癌組織和細胞系中的表達

A、B ：15例RCC及其配對的癌旁組織的FAM64A的相對表達量；C：FAM64A在RCC細胞系里的表達量；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

表1 FAM64A的表達水平與患者臨床病理特征之間相關(guān)性分析(n)

圖2 FAM64A的表達量與愈后相關(guān)

2.3 FAM64A可以促進RCC細胞的增殖在FAM64A相對高表達的786-O細胞中轉(zhuǎn)染FAM64A特異性小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)后，分別通過RT-qPCR及Western blot檢測786-O細胞中FAM64A mRNA和蛋白的表達變化(P<0.05)，見圖3A；正常對照組(normal control，NC)，siR1為FAM64A特異性干擾RNA1，siR2為FAM64A特異性干擾RNA2；與正常對照比較，轉(zhuǎn)染FAM64A-siRNA后786-O細胞中FAM64A表達水平明顯降低，說明FAM64A-siRNA可下調(diào)其表達，同時Cyclin B1的表達量下調(diào)，見圖3B；CCK-8結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染FAM64A-siRNA后，786-O細胞的增殖能力受到明顯抑制(P<0.05)，見圖3C。提示FAM64A可以促進RCC細胞的增殖。在FAM64A相對低表達的ACHN細胞中通過慢病毒感染穩(wěn)定過表達FAM64A后，通過RT-qPCR及Western blot檢測ACHN細胞中FAM64A和Cyclin B1的表達變化(P<0.05)，見圖4A； 過表達組(over expression，OE)，慢病毒轉(zhuǎn)染后FAM64A和Cyclin B1的表達水平明顯上調(diào)，見圖4B。CCK-8結(jié)果顯示，過表達FAM64A后，ACHN細胞的增殖能力明顯增強(P<0.05)。見圖4C。

2.4 FAM64A能加快細胞G2/M期進程在786-O細胞中通過FAM64A-siRNA敲低FAM64A后，利用細胞周期同步化技術(shù)使用過量的胸苷將細胞同步阻滯在G1期后，開始釋放，收集不同時間點的細胞提取蛋白，通過Werstern blot方法檢測細胞周期G2/M期檢測點標志性分子Cyclin B1水平變化，觀察FAM64A對細胞周期的影響。結(jié)果顯示，正常786-O細胞系中Cyclin B1開始升高的時間點為釋放后4 h，敲低FAM64A后，Cyclin B1升高時間推遲到6 h。該結(jié)果表明過表達FAM64A后得到Cyclin B1水平升高時間提前，可加快細胞通過G2/M期。見圖5。

圖3 下調(diào)FAM64A后786-O細胞的增殖能力

A：FAM64A敲低后mRNA表達水平；B：FAM64A敲低后的蛋白表達水平及Cyclin B1的蛋白表達水平；C：FAM64A敲低后細胞增殖能力；與NC組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

前期轉(zhuǎn)錄組測序首次發(fā)現(xiàn)FAM64A在RCC組織中高表達[9]，隨后又在15例RCC與癌旁組織以及RCC細胞系中驗證了這一結(jié)果，發(fā)現(xiàn)FAM64A的確在RCC組織和細胞中高表達；同時通過TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析得出FAM64A的表達與RCC患者的性別、腫瘤分級以及預(yù)后相關(guān)。這提示FAM64A的異常表達可能與RCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Hashimoto et al[6]報道FAM64A在小鼠胚胎時期的心肌細胞中高表達，并且FAM64A的高表達與心肌細胞的增殖密切相關(guān)；但當心肌細胞接觸氧后FAM64A的表達量明顯下降。Hu et al研究[8]報道FAM64A在多種腫瘤如廣泛高表達，敲低FAM64A后可以抑制腫瘤細胞的生長，但其具體分子調(diào)控機制尚不明確。

圖4 過表達FAM64A后ACHN細胞的增殖能力

A： FAM64A過表達后mRNA表達水平；B：FAM64A過表達后蛋白表達水平及Cyclin B1的蛋白表達水平；C：FAM64A過表達后細胞增殖能力；與NC組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖5 FAM64A能加快細胞進入M期

Zhao et al[10]研究報道FAM64A作為原癌基因可通過加快細胞通過G2/M期以促進細胞周期，以及細胞增殖；FAM64A有可能作為一個新的細胞增殖標志物[7]。目前為止尚沒有FAM64A對RCC細胞發(fā)生發(fā)展的研究，為了進一步驗證FAM64A與RCC細胞增殖的相關(guān)性，選擇FAM64A相對高表達和低表達的RCC細胞系786-O和ACHN作為研究模型，同干擾RNA敲低FAM64A后786-O細胞增殖減慢，而過表達FAM64A后ACHN細胞增殖加快。Cyclin B1是細胞G2/M期的關(guān)鍵性標志物，Cyclin B1的高表達可加快細胞周期促進細胞增殖。在ACHN細胞中過表達FAM64A后發(fā)現(xiàn)Cyclin B1隨FAM64A表達量的增加而升高；在786-O細胞系中敲低FAM64A后Cyclin B1隨FAM64A表達量的減少而降低。為了進一步驗證FAM64A和Cyclin B1的關(guān)系，通過細胞周期同步化實驗發(fā)現(xiàn)FAM64A低表達可以推遲Cyclin B1升高的時間點，進而影響RCC細胞G2期向M期的轉(zhuǎn)換。FAM64A可以通過調(diào)控Cyclin B1的表達而影響RCC的細胞周期和增殖。通過對FAM64A腎癌細胞系中的功能研究，確定FAM64A作為原癌基因通過加速RCC細胞通過G2/M期以加速細胞增殖，這提示FAM64A與RCC細胞的增殖密切相關(guān)，這為今后靶向治療提供一定的支持。但FAM64A作用的具體分子機制尚不清楚。Archangelo et al[11]研究表明FAM64A可作為一種激酶的底物被磷酸化，并可與該激酶共同定位在細胞核中進而促進細胞增殖?，F(xiàn)階段研究[6-8,10-11]表明FAM64A在細胞內(nèi)擔當多種功能，但是具體的分子機制和信號通路尚不清楚。這需要后期進一步工作來確定FAM64A的具體分子機制。