張 杰,李 研，楊 琳，李新欣，趙 新，候珺淇，代振玉

(周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466001)

DNA是遺傳信息的載體，是重要的生物信息分子，是生物學(xué)研究的主要對(duì)象. 微生物DNA提取過(guò)程中遇到許多純度不夠高、方法通用性不強(qiáng)、提取速度慢的問(wèn)題. 在過(guò)去的五年內(nèi)，總共有3 000多篇文章報(bào)道過(guò)利用試劑盒或CTAB法提取微生物DNA或 RNA的研究，文章中有160 000多條基因或基因組序列被公布[1].

微生物DNA的提取有很多方法，例如細(xì)菌可以采用SDS-酶裂解法，霉菌和酵母菌采用改良的氯化芐法，而放線菌采用改良酶法. 這些方法的簡(jiǎn)要步驟如下：通過(guò)對(duì)培養(yǎng)的微生物菌落進(jìn)行比較和篩選，選擇出長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落(細(xì)菌、霉菌、酵母菌和放線菌菌落)，然后利用改進(jìn)的CTAB法對(duì)不同微生物菌落的DNA進(jìn)行提取. DNA提取過(guò)程中細(xì)胞破壁的方法有液氮研磨法、石英砂振蕩研磨法和高溫加熱法等[1-2]、改良酶或化學(xué)法破壁[3]. 國(guó)內(nèi)外已報(bào)道了多種酵母菌總DNA制備的方法，但它們都存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)[4-6]. 關(guān)于真菌DNA提取的方法，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多報(bào)道. 目前存在和使用的真菌DNA提取方法步驟大體相似[7-9]，主要差別在于破壞真菌菌絲、孢子的細(xì)胞壁的方式不同和提取緩沖液的配方有差異.

常采用試劑盒提取微生物DNA，從細(xì)胞中提取的DNA數(shù)量較少，很難滿足Southern印跡等試驗(yàn)的要求. CTAB法可在短時(shí)間內(nèi)制備大量DNA樣品，但是提取過(guò)程中常用一些對(duì)人體有害的試劑，如氯仿、酚和巰基乙醇，通用性較弱，需要針對(duì)不同的樣品改變配方[10-12].

本研究通過(guò)對(duì)微生物的4種代表菌種(霉菌、酵母菌、細(xì)菌和放線菌)的DNA提取方法的比較，獲得了微生物DNA提取通用試劑盒的配制方法，該方法不使用對(duì)人體有害的試劑，從而為微生物DNA快速、方便和廉價(jià)的提取提供了科學(xué)依據(jù)，促使CTAB法在微生物DNA提取時(shí)更具通用性和方便性.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從宋河酒業(yè)提供的酒糟中分離出來(lái)的細(xì)菌、霉菌、放線菌和酵母菌為研究對(duì)象，采用筆者制備的DNA extraction kit試劑盒提取其DNA.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑盒的操作流程

改進(jìn)的 CTAB法操作步驟如下： 樣品破碎(多樣品冷凍研磨儀PS-24研磨)→取50 mg樣品粉末，加入800 μL的dissociation buffer(CTAB抽提液，內(nèi)含1% PVP)，劇烈渦旋 →65 ℃水浴10 min，該期間充分混合樣品兩次 →加入140 μL purification buffer(酚、碳酸二甲酯、異戊醇的比例為25∶24∶1)渦旋混合樣品. 10 000×g離心10 min →小心吸取上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新離心管中，而后加0.7倍體積的異丙醇并渦旋以便沉淀DNA →10 000 × g離心2 min沉淀DNA →小心吸取或輕輕倒出上清液并棄去，確保DNA不被丟掉 →加300 μL C液(無(wú)菌去離子水)重懸DNA，無(wú)菌去離子水提前預(yù)熱到65 ℃. 加入4 μL RNase A 并混勻 →將整個(gè)樣品 (包括形成的沉淀) 轉(zhuǎn)移到放有收集管的HiBind? DNA column中，10 000× g離心1 min，棄濾液. 轉(zhuǎn)移柱子到一個(gè)新收集管上→加入700 μL DNA wash buffer(70%乙醇)，10 000× g離心1 min，棄濾液 →將柱子最大轉(zhuǎn)速離心2 min至干燥 →將柱子轉(zhuǎn)移到干凈的1.5 mL的離心管中，加入50～80 μL的C液(C液提前65 ℃預(yù)熱) 室溫靜置20 min，10 000 × g 離心3～5 min →瓊脂糖凝膠電泳和微量核酸檢測(cè)儀測(cè)其濃度和純度，-80 ℃保存?zhèn)溆?

備注：新的提取過(guò)程中，用dissociation buffer與CTAB抽提液相比增加了1% PVP，purification buffer(酚、碳酸二甲酯、異戊醇的比例為25∶24∶1)代替了原有的純化溶液(酚、氯仿、異戊醇的比例為25∶24∶1)，DNA的純化過(guò)程增加了DNA收集柱，DNA溶解液用去離子的elution buffer代替了雙蒸水.

1.2.2 菌株樣品的制備

(1)分別將細(xì)菌、霉菌、放線菌和酵母菌接種到相應(yīng)的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，收集菌體放置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

(2) 分別將細(xì)菌、霉菌、放線菌和酵母菌接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽慮收集菌體放置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2.3 DNA質(zhì)量檢測(cè)

(1)DNA的感官評(píng)定： DNA沉淀物自然干燥后，通過(guò)對(duì)其顏色的觀察，感官上評(píng)定糖、酚等一些雜質(zhì)的污染程度. 含糖比較多的DNA沉淀時(shí)，沉淀物常常呈膠狀，純DNA則為絮狀等沉淀；含有酚類雜質(zhì)的DNA沉淀物多呈黃色至深褐色，難以溶解或溶液顏色深，純DNA為類似石棉樣的白色纖維狀物.

(2)微量核酸檢測(cè)儀Agilent 2100檢測(cè)DNA質(zhì)量曲線圖:全波長(zhǎng)的分光光度計(jì)核酸檢測(cè)儀NanoDrop ND-1000(波長(zhǎng)范圍為 220 nm～750 nm)測(cè)定提取DNA的質(zhì)量和濃度. DNA的純度主要指標(biāo)包括蛋白質(zhì)、糖、RNA及其他雜質(zhì)污染的程度，可通過(guò)OD260/OD280比值判斷. 通常OD260/OD280比值越接近1.8，表明DNA越純；在1.8～2.0之間表明有RNA污染；大于2.0表明DNA有降解或RNA比較多；小于1.8有蛋白質(zhì)污染. OD260/OD230比值應(yīng)在2～2.5之間，偏小則表明有鹽殘余.

(3)瓊脂糖凝膠評(píng)定：通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳評(píng)定DNA的質(zhì)量和濃度.

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量的感官評(píng)定

表1 提取孢子DNA的感官分析

由表1可知，通過(guò)該試劑盒提取到的4種微生物孢子的DNA狀態(tài)和顏色均符合高質(zhì)量DNA的要求，說(shuō)明該提取方法提取到的DNA符合感官要求.

表2 提取菌體DNA的感官分析

由表2可知，通過(guò)該試劑盒提取到的4種微生物菌體的DNA狀態(tài)和顏色均符合高質(zhì)量DNA的要求，說(shuō)明該提取方法提取到的DNA符合感官要求.

由圖1A可知，該試劑盒提取到的4種微生物孢子的DNA在液體沉淀中出現(xiàn)白色絮狀沉淀，且無(wú)明顯的雜質(zhì). 由圖1B可知，該試劑盒提取到的4種微生物菌絲體的DNA在液體沉淀中出現(xiàn)白色絮狀沉淀，且無(wú)明顯的雜質(zhì).

上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明該試劑盒能夠提取到4種微生物的孢子或菌絲體的DNA，且提取到的DNA在感官上符合要求.

圖1 提取的DNA在液體中的形態(tài)

2.2 DNA質(zhì)量的理化檢測(cè)

為了檢測(cè)試劑盒提取到的DNA質(zhì)量，用Agilent 2100和NanoDrop檢測(cè)了所提樣品的片段大小、純度和濃度. 由圖2和圖3可知，試劑盒所提取到的DNA主峰片段大小在3 000～7 000 bp范圍之內(nèi)，而次峰的片段大小在200～400 bp和12 000 bp左右，表明提取的DNA能夠滿足下游實(shí)驗(yàn)需求. 由圖2和圖3的主峰比較可知，提取到的孢子DNA的濃度比菌絲體DNA的濃度稍低.

圖2 Agilent 2100檢測(cè)提取孢子DNA質(zhì)量曲線效果圖

圖3 Agilent 2100檢測(cè)提取菌體DNA質(zhì)量曲線效果圖

用NanoDrop分別檢測(cè)了提取的孢子和菌絲體DNA的OD260/280和OD260/230的比值. DNA的OD260/280比值大于1.8，小于2.1；OD260/230的比值均大于2.0，小于2.5 (見表3和表4). 上述結(jié)果表明所提樣品DNA均符合下游實(shí)驗(yàn)的要求，該試劑盒提取DNA時(shí)具有通用性，提取的DNA質(zhì)量較高.

表3 NanoDrop檢測(cè)提取孢子DNA質(zhì)量結(jié)果

表4 NanoDrop檢測(cè)提取菌體DNA質(zhì)量結(jié)果

2.3 DNA質(zhì)量的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

A固體培養(yǎng)基上的孢子DNA B液體培養(yǎng)基的菌絲或菌體DNA圖4 瓊脂糖凝膠檢測(cè)的DNA質(zhì)量

瓊脂糖凝膠電泳條帶的亮度和整齊度能直觀評(píng)定DNA的完整性和高質(zhì)量性. 由圖4可知，提取的孢子和菌絲體DNA的電泳圖像與Marker相比較，可以看出試劑盒提取的DNA電泳的條帶整齊、明亮和Marker主條帶無(wú)差異. 上述結(jié)果表明：該試劑盒提取的DNA質(zhì)量和濃度均能滿足下游實(shí)驗(yàn)的需要.

3 討論

CTAB法是傳統(tǒng)的提取DNA的方法，它操作過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉. 但是傳統(tǒng)的CTAB法使用了氯仿和β-巰基乙醇等不利于人體健康的試劑[13]. 市場(chǎng)上和臨床試驗(yàn)中應(yīng)用的800個(gè)微生物源天然化合物中[8]，來(lái)源于放線菌的抗生素占整個(gè)抗生素的67%(鏈霉菌占52%，稀有放線菌占15%). 故利用分子生物學(xué)的方法研究這些微生物是必然的趨勢(shì)[14]. 分子生物學(xué)研究方法的首要步驟就是提取目的DNA[9].

各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分差別很大，例如真菌細(xì)胞壁主要成分為幾丁質(zhì)，與細(xì)菌相比其結(jié)構(gòu)要堅(jiān)固得多. 在提取DNA時(shí)該菌類的培養(yǎng)時(shí)間盡可能短，一般以20 h左右為最佳. 而本試劑盒，從4種菌的孢子和菌絲體中均提取到了高質(zhì)量的DNA，說(shuō)明了該試劑盒的通用性. 含多糖聚合物 DNA 的提取比較困難[15]，本試劑盒在傳統(tǒng)的CTAB法上增加了HiBind? DNA column吸附DNA，然后再收集DNA，這樣降低了多糖聚合物的污染，獲得了高質(zhì)量的DNA.