王帥，李慧，賀羽*

(1.徐州工程學(xué)院 食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.徐州工程學(xué)院江蘇省 食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221018)

乳酸菌發(fā)酵調(diào)味醋是一種擁有悠久歷史傳統(tǒng)的民間酸性飲料，早在我國古代的秦朝就已經(jīng)產(chǎn)生，是一種以糖茶水為原料，經(jīng)酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等菌種一起發(fā)酵制作而成的功能性保健調(diào)味品，酸甜可口，純天然保健飲品[1,2]。由于乳酸菌菌液本身pH值較低及發(fā)酵過程中產(chǎn)生的抑菌成分使其具有非常強(qiáng)的抑菌作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌液對亞硝酸鹽具有一定的降解作用[4]。發(fā)酵調(diào)味醋中還含有如醋酸、葡萄糖醛酸等對人體有益的物質(zhì)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，醋酸有抗疲勞、提升食欲、助消化、防治高血壓和動脈硬化的作用，還有如抗腫瘤、預(yù)防肥胖、幫助人體鈣質(zhì)吸收、保持骨骼強(qiáng)韌和潤滑皮膚的作用[5-7]。發(fā)酵醋產(chǎn)品不僅用于食品調(diào)味，亦可作為液體飲料，還可以利用復(fù)合菌株結(jié)合水果、肉類等原料研制出有特殊風(fēng)味的低糖果脯和低膽固醇肉脯，已作為一種天然調(diào)味品應(yīng)用于食品加工產(chǎn)業(yè)[8,9]。除了復(fù)合菌株發(fā)酵調(diào)味產(chǎn)品的開發(fā)外，人們對乳酸菌本身的研究還不多。諸如抑菌作用、抗氧化性、防癌抗癌等特性僅僅是其益處的冰山一角，即使這些方面也未能被研究透徹。復(fù)合菌株發(fā)酵調(diào)味品保健作用的機(jī)理復(fù)雜，需要更加深入地進(jìn)行探究。

近些年，人們越來越注重健康、養(yǎng)生，特別是食品的功效。牛蒡的食用藥用價值極高，受到注重日常保健的人們的重視。牛蒡成分有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫及抗炎、抗糖尿病、抗菌、抗疲勞等功效，是人們?nèi)粘１＝『皖A(yù)防很多疾病的重要食藥材[10]。本課題以感官鑒評為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)，探尋牛蒡-乳酸菌復(fù)合調(diào)味發(fā)酵醋的最佳配方，包括復(fù)合菌種及牛蒡的添加比例、白砂糖的用量等。對添加不同量的牛蒡、復(fù)合菌種和白砂糖的發(fā)酵飲料的口感、氣味及顏色差異進(jìn)行分析，確定最優(yōu)選擇。成品復(fù)合發(fā)酵調(diào)味醋制作完成之后，測定9個樣品的有效酸度及菌落總數(shù)。研究并開發(fā)牛蒡等營養(yǎng)價值極高的食材添加發(fā)酵調(diào)味品的生產(chǎn)制作，不僅使得食品工業(yè)有了新的發(fā)展方向，還為開發(fā)新型復(fù)合發(fā)酵調(diào)味醋提供了新的思路，使其得到更好的發(fā)展。

1 原料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用牛蒡、白砂糖購自徐州農(nóng)貿(mào)市場。發(fā)酵所用嗜熱鏈球菌StreptococcusthermophilusKP4、嗜酸乳桿菌LactobacillusacidophilusKP15和植物乳桿菌LactobacillusplantarumKP59為本課題組篩選保藏菌株，已經(jīng)過毒理及益生檢測。

1.2 主要儀器與設(shè)備

JA2104N型電子天平、電熱恒溫干燥機(jī)、冰箱、電磁爐、HPX-9052MBE電熱恒溫培育箱、存儲罐、超凈工作臺。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 技術(shù)路線

牛蒡→清洗去皮切片→粗制牛蒡茶→過濾→灌裝→調(diào)味→發(fā)酵→感官鑒評→指標(biāo)檢測→包裝。

2.2 牛蒡紅茶菌復(fù)合發(fā)酵飲料的正交實(shí)驗(yàn)

2.2.1 單因素水平的確定

據(jù)課題組益生特性實(shí)驗(yàn)，S.thermophilusKP4、L.acidophilusKP15和L.plantarumKP59添加比例為1∶1∶3，混勻后，35 ℃厭氧發(fā)酵48 h。取牛蒡用量、復(fù)合菌種用量、白砂糖添加量3個因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。研究此3個因素對牛蒡-紅茶菌復(fù)合發(fā)酵飲料的風(fēng)味的影響，添加復(fù)合發(fā)酵菌株進(jìn)行發(fā)酵。

分別稱取30，40，50，60，70 g牛蒡加入300 mL水煮制牛蒡茶。取35 g復(fù)合菌種發(fā)酵液、30 g白砂糖按上述技術(shù)路線制作復(fù)合發(fā)酵調(diào)味醋。對制得的飲料進(jìn)行感官評分，以確定最佳牛蒡用量。

確定最佳牛蒡用量后，用300 mL水煮制此牛蒡含量的牛蒡茶。再取30 g白砂糖，分別用15，25，35，45，55 g菌種發(fā)酵液。對制得的調(diào)味醋進(jìn)行感官評分，以確定最佳復(fù)合菌種用量。

確定上述兩個條件后，再分別稱取10，20，30，40，50 g白砂糖制作飲料。對制得的調(diào)味醋進(jìn)行感官評分，確定白砂糖的添加量。

2.2.2 正交試驗(yàn)

經(jīng)上述單因素試驗(yàn)可知牛蒡-復(fù)合菌株發(fā)酵調(diào)味醋的最優(yōu)單因素水平為：牛蒡用量17%，復(fù)合菌種用量12%，白砂糖添加量13%。根據(jù)該最優(yōu)單因素水平數(shù)據(jù)，按L9(34)正交試驗(yàn)方案進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3 感官評定指標(biāo)

隨機(jī)選擇30名經(jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)感官評定員組成感官評定小組對飲料進(jìn)行感官評分，感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory scoring criteria

續(xù) 表

評定人員對表1中的各項(xiàng)細(xì)分標(biāo)準(zhǔn)給產(chǎn)品打分，記錄每一細(xì)分標(biāo)準(zhǔn)的分值，最終計(jì)算綜合總分。根據(jù)最終的分?jǐn)?shù)高低來評價產(chǎn)品的優(yōu)劣。

2.4 牛蒡復(fù)合菌株發(fā)酵調(diào)味醋營養(yǎng)品質(zhì)分析

根據(jù)感官評定得出最優(yōu)牛蒡復(fù)合菌株發(fā)酵調(diào)味醋配方，進(jìn)而對其進(jìn)行營養(yǎng)品質(zhì)分析。

2.4.1 有效酸度的測定

本實(shí)驗(yàn)采用電位分析法(pH計(jì))對混合發(fā)酵調(diào)味醋的有效酸度進(jìn)行測定。先配制標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液，pH 4.0標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液：將10.1200 g優(yōu)級純鄰苯二甲酸氫鉀溶解于1000 mL高純水中；pH 6.86標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液：將2.3870 g優(yōu)級純磷酸二氫鉀和2.5330 g優(yōu)級純磷酸氫二鈉溶解于1000 mL高純水中。再進(jìn)行pH計(jì)校正：按照儀器使用說明書上的操作方法用pH 6.86和pH 4.0的緩沖溶液對pH計(jì)進(jìn)行兩點(diǎn)校正。最后進(jìn)行調(diào)味醋pH值的測定：用蒸餾水沖洗電極3～5次，用濾紙吸干，然后將電極放入樣品中，等pH值穩(wěn)定后讀數(shù)，每個樣品重復(fù)測定3次，記錄數(shù)據(jù)。測定完畢后，清洗干凈電極，把電極浸泡在蒸餾水中。

2.4.2 菌落總數(shù)的測定

菌落總數(shù)是食品衛(wèi)生情況的一個重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)參考國標(biāo)GB 4789.2-2016對復(fù)合發(fā)酵調(diào)味醋中的菌落總數(shù)進(jìn)行測定，具體操作步驟如下：

9個飲料樣品分別取25 mL與各225 mL生理鹽水于9個錐形瓶中標(biāo)號混勻，制成1∶10的樣品勻液。然后用1 mL移液槍吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注入盛有9 mL生理鹽水的試管中，制成1∶100的樣品勻液，分別標(biāo)號。最后重復(fù)上一步驟制備1∶1000的樣品勻液，分別標(biāo)號。制完樣品勻液后，各取1 mL均勻涂布于瓊脂培養(yǎng)皿中，對照標(biāo)號，需注意的是全程都需在無菌操作臺上完成。再將涂布好的培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。待培養(yǎng)完成后觀察計(jì)數(shù)。

菌落總數(shù)計(jì)算公式見下式：

N=∑C/(n1+0.1n2)d。

式中：N為樣品中菌落數(shù)；C為平板菌落數(shù)之和；n1為第一稀釋度平板個數(shù)；n2為第二稀釋度平板個數(shù)；d為稀釋因子(第一稀釋度)。

通過觀察及上述計(jì)算公式可以計(jì)算出樣品菌落總數(shù)，依據(jù)國標(biāo)規(guī)定，調(diào)味醋飲料的菌落總數(shù)不得超過3×104CFU/mL，本產(chǎn)品符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 復(fù)合發(fā)酵調(diào)味醋的感官試驗(yàn)評定

3.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

取牛蒡用量、混合菌株用量、白砂糖添加量3個因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。研究3個因素對發(fā)酵調(diào)味醋風(fēng)味的影響，結(jié)果見表2～表4。

表2 牛蒡用量對感官品質(zhì)的影響Table 2 Effect of burdock dosage on sensory quality

表3 紅茶菌用量對感官品質(zhì)的影響Table 3 Effect of the dosage of black tea fungus on sensory quality

表4 白砂糖添加量對感官品質(zhì)的影響Table 4 Effect of the additive amount of sugar on sensory quality

根據(jù)上述感官評分?jǐn)?shù)據(jù)，繪制牛蒡用量、紅茶菌種用量、白砂糖添加量3個因素對牛蒡-紅茶菌復(fù)合發(fā)酵飲料的風(fēng)味的影響曲線圖，見圖1。

圖1 風(fēng)味的影響曲線Fig.1 The influence curves of flavor

注：A為牛蒡用量對感官品質(zhì)的影響；B為菌株發(fā)酵液用量對感官品質(zhì)的影響；C為白砂糖添加量對感官品質(zhì)的影響。

由圖1可知，牛蒡-復(fù)合菌發(fā)酵調(diào)味醋的牛蒡用量在40～60 g 時感官評分較高，醋飲料品質(zhì)上乘，當(dāng)用量在30～40 g、60～70 g時飲料的品質(zhì)略顯粗糙；菌種發(fā)酵液用量在25～45 g時感官評分較高，風(fēng)味最佳，當(dāng)用量在15～25 g、45～55 g時風(fēng)味較差；白砂糖添加量在20～40 g時感官評分相對較高，口感最好，當(dāng)白砂糖添加量在10～20 g、40～50 g時飲料口感不好。綜上所述，飲料的最優(yōu)單因素水平為：牛蒡用量40～60 g，菌種發(fā)酵液用量25～45 g，白砂糖添加量20～40 g。根據(jù)所得最優(yōu)單因素水平數(shù)據(jù)，按L9(34)試驗(yàn)方案制作牛蒡-紅茶菌復(fù)合發(fā)酵飲料，以感官評分為評價指標(biāo)，試驗(yàn)因素及水平編碼見表5。

表5 因素水平表Table 5 Factors and levels g

3.1.2 復(fù)合發(fā)酵調(diào)味醋配方的正交試驗(yàn)結(jié)果

為優(yōu)化牛蒡-復(fù)合菌發(fā)酵調(diào)味醋的配方，得出最佳方案，根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，采取L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of orthogonal experiment

在本試驗(yàn)中，各列的極差是不相等的，這說明各因素的水平改變對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響是不同的，由表6可知，RB>RA>RC，所以各因素的從主到次的順序?yàn)椋築(紅茶菌用量)>A(牛蒡用量)>C(白砂糖添加量)。試驗(yàn)的指標(biāo)是感官評分，指標(biāo)越大越好，所以應(yīng)挑選每個因素的k1，k2，k3中最大值對應(yīng)的那個水平，由于A因素列：k2>k3>k1；B因素列：k2>k3>k1；C因素列：k3>k2>k1。所以，最優(yōu)方案為A2B2C3。由正交表的結(jié)果可知，對產(chǎn)品感官影響最大的是紅茶菌種用量，其次是牛蒡用量，而白砂糖用量的影響是最小的。發(fā)酵調(diào)味醋的最佳配方是A2B2C3，即牛蒡用量50 g，復(fù)合菌種用量35 g，白砂糖添加量40 g。此組合已經(jīng)出現(xiàn)在方案中，感官評定的得分為最高分88.10分，即該方案為最優(yōu)方案。

3.2 營養(yǎng)品質(zhì)分析結(jié)果

3.2.1 有效酸度的測定結(jié)果

利用pH計(jì)對復(fù)合發(fā)酵調(diào)味醋的有效酸度進(jìn)行測定，試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 樣品的有效酸度Table 7 Effective acidity of samples

在食品酸度測定中，有效酸度的測定往往比測定總酸度更具有實(shí)際意義。其大小說明了食品介質(zhì)的酸堿性。依據(jù)相關(guān)研究報告，市場上的果珍、維他命水、茉莉花茶的有效酸度一般分別為3.27，3.39，5.85。由表7可知，本實(shí)驗(yàn)牛蒡-復(fù)合菌株發(fā)酵調(diào)味醋中的有效酸度pH值范圍為3.05～3.35。對比可知，本調(diào)味醋酸甜適中，風(fēng)味上佳，營養(yǎng)更豐富，會是非常受歡迎的保健醋品。

3.2.2 菌落總數(shù)的測定結(jié)果

按國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測復(fù)合發(fā)酵調(diào)味醋最佳配方的菌落總數(shù)，結(jié)果見表8。

表8 樣品菌落總數(shù)Table 8 Total bacterial bacterial number of samples

表9 最佳配比調(diào)味醋中菌落總數(shù)報告Table 9 Report on the total bacterial colony colony of seasoning vinegar with the optimum proportion

由表9可知，牛蒡-復(fù)合菌發(fā)酵調(diào)味醋的最優(yōu)配比飲料樣品中的菌落總數(shù)為1.85×104CFU/mL，符合國家標(biāo)準(zhǔn)中對菌落總數(shù)3.0×104CFU/mL的指標(biāo)。

4 討論

近年來，已經(jīng)有很多優(yōu)秀的研究者做出了令人拍手稱贊的優(yōu)秀成果。杜青平[11]利用3種共生微生物對糖茶水進(jìn)行發(fā)酵后的原液與紅棗汁配比，形成了一種風(fēng)味特別的復(fù)合發(fā)酵飲料；郭書賢等[12]用雙酶法來制取紅薯糖漿用來代替白砂糖進(jìn)行紅茶菌飲料的發(fā)酵，使得復(fù)合飲料具有紅薯的特殊香味，口感更柔和，營養(yǎng)更加豐富。而羅長輝等[13]采用固體發(fā)酵方式用紅茶菌對SC5木薯-銀合歡蛋白飼料進(jìn)行了發(fā)酵，生產(chǎn)出了性能更加優(yōu)良的飼料。這些人的優(yōu)秀研究成果給未來研究者們指明了方向，也增強(qiáng)了研究者們的信心，相信不久的將來，在復(fù)合菌株發(fā)酵產(chǎn)品開發(fā)方面會有更多令人驚喜的發(fā)現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)以感官評定作為指標(biāo)對牛蒡-復(fù)合乳酸菌發(fā)酵茶味調(diào)味醋的配方進(jìn)行分析，通過單因素試驗(yàn)和L9(34)正交試驗(yàn)確定了該產(chǎn)品的最佳配方。結(jié)果表明，牛蒡-乳酸菌復(fù)合發(fā)酵茶味調(diào)味醋的最佳配方為每300 mL飲料牛蒡用量17%，復(fù)合菌種用量12%，白砂糖添加量13%。在此工藝條件下，發(fā)酵調(diào)味醋的外觀、氣味、口感是最佳的，比普通果醋、調(diào)味醋品質(zhì)更勝一籌。而且，其出色的口感、怡人的香味和獨(dú)有的保健作用能夠吸引消費(fèi)者的喜愛。同時，分別采取電化學(xué)分析法，平板菌落計(jì)數(shù)法等方法對最佳配方的飲料的有效酸度和菌落總數(shù)進(jìn)行分析。檢測結(jié)果表明各項(xiàng)衛(wèi)生指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，可作為營養(yǎng)健康的復(fù)合發(fā)酵醋品飲料，用于日常食品調(diào)味及平常保健飲用。

牛蒡作為食藥同源植物，營養(yǎng)價值極為豐富，深受人們喜愛。乳酸菌則是中國傳統(tǒng)的發(fā)酵菌種。二者相結(jié)合，制作口感、風(fēng)味獨(dú)具風(fēng)格的復(fù)合發(fā)酵調(diào)味品，物盡其用，使得這種成本低廉的保健方式得以進(jìn)入尋常百姓家中。未來，類似牛蒡這樣營養(yǎng)價值極高的植材進(jìn)入人們?nèi)粘Ｏ矏鄣恼{(diào)味品及飲料中將成為常態(tài)，既豐富了食物的口味，又提供了普通調(diào)味品所不具備的營養(yǎng)。類似復(fù)合菌種發(fā)酵調(diào)味品、飲品等也都需要我們?nèi)グl(fā)掘并發(fā)揚(yáng)光大。隨著人們生活水平的提高，對生活品質(zhì)的追求，相信此類產(chǎn)品將更受歡迎。