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        DGGE法分析醬菜中酵母菌多樣性

        2019-10-17 09:24:28燕平梅魏愛麗陳燕飛趙文婧
        中國調(diào)味品 2019年10期
        關(guān)鍵詞:醬菜條帶酵母菌

        燕平梅,魏愛麗,陳燕飛,趙文婧

        (1.太原師范學院 生物系,太原 030619;2.太原師范學院土壤消毒活化 綠色產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟,太原 030619)

        蔬菜醬制這一加工蔬菜的方法在我國由來已久。由于制作方法簡單易學,原料可以直接從當?shù)孬@得,因此在我國許多地方形成了獨具風味的產(chǎn)品。醬菜是常見的發(fā)酵食品之一,醬菜的生產(chǎn)主要依賴于微生物發(fā)酵的工藝。從發(fā)酵醬菜的體系中分離出的微生物有細菌、酵母菌和霉菌類等。其中細菌類的代表菌株是胚芽乳酸桿菌、短桿菌,酵母菌類的代表菌株是假絲酵母、醬油酵母,霉菌類的代表菌株是青霉、白地霉等[1,2]。醬菜不僅可以調(diào)節(jié)口味,還具有促進腸道消化吸收的作用[3,4]。

        研究醬菜中酵母菌多樣性的方法有培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法。由于培養(yǎng)法在實際操作過程中工作量大且繁瑣,故更多的人選擇非培養(yǎng)法來研究體系中微生物的多樣性。 其中培養(yǎng)法包括磷脂脂肪酸法、生理方法的鑒定系統(tǒng)和分子生物學方法[5]。近年來,分子生態(tài)學技術(shù)快速發(fā)展,受到了廣大科研工作者的喜愛。該技術(shù)主要通過分析微生物的基因序列信息研究發(fā)酵體系中微生物的多樣性與功能性[6]。其中DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)技術(shù)更是得到了廣泛的應用。DGGE技術(shù)是由Fischer和Lerman率先提出的[7]。1993年,Muyzer等[8]首次將其應用于微生物生態(tài)學研究。目前,DGGE技術(shù)被廣泛用于環(huán)境微生態(tài)方面的研究。2015年,趙柏霞等用PCR-DGGE技術(shù)研究接種了枯萎病菌后黃瓜根際土壤細菌群落的變化,發(fā)現(xiàn)接種枯萎病菌后黃瓜根際土壤細菌的數(shù)量及種類發(fā)生了較大變化[9]。呂文洲等[10]的研究結(jié)果表明,PCR-DGGE技術(shù)用于解析油脂廢水系統(tǒng)中酵母菌群落結(jié)構(gòu)的可行性。張先琴等[11]用PCR-DGGE技術(shù)分析了四川地區(qū)家庭制作泡菜中微生物的多樣性,結(jié)果表明細菌的種類較豐富,而真菌的種類較少。本實驗以兩種市售的醬菜樣品為實驗材料,采用PCR-DGGE技術(shù)探究醬菜中酵母菌的多樣性。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        1.1.1 材料

        3袋袋裝小青瓜(原料∶青瓜)和3袋袋裝醬黃瓜(原料∶青瓜)的混合醬菜,以JA表示;散裝醬菜(原料:黃瓜和青瓜),以JB表示。

        1.1.2 試劑

        細菌基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取試劑盒:索萊寶生物有限公司;N,N,N′,N′-四甲基乙二胺、去離子甲酰、過硫酸銨、尿素(均為分析純):美國AMRESCO公司;2×Taq Master Mix、DH5a感受態(tài)細胞:天根生物技術(shù)有限公司;引物:由上海生物工程公司合成。

        1.2 儀器與設備

        TC-96(G)H(b)B Life Touch基因擴增儀 杭州博日科技有限公司;DcodeTM凝膠成像系統(tǒng)、DcodeTM濃度梯度電泳儀 美國Bio-Rad公司;DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠。

        1.3 方法

        1.3.1 醬菜中微生物基因組DNA的提取

        將袋裝醬菜編號為JA,散裝黑色醬菜編號為JB。首先用滅菌濾紙對醬菜汁進行過濾。兩種醬菜汁各取18 mL于9支2 mL的離心管中,8000 r離心5 min。倒盡上清液,收集沉淀,再次離心,倒盡上清液。使用DNA提取試劑盒提取DNA,1%的瓊脂糖凝膠檢測,于-20 ℃保存。

        1.3.2 26S rDNA的PCR擴增

        在引物合成公司合成擴增所需的上游引物與下游引物。

        上游引物為NL1-GC(cgc ccg ccg cgc ggc ggg cgg ggc ggg ggc gcg ata tca ata agc gga gga aaa g);

        下游引物為LS2(att ccc aaa caa ctc gac tc)。

        反應體系:PCR Master 12.5 μL,每種引物1 μL,微生物總DNA 1.5 μL,加ddH2O至25 μL。

        1.3.3 PCR產(chǎn)物變性梯度凝膠電泳(DGGE)

        變性梯度凝膠的配方見表1。

        表1 變性梯度凝膠的配方Table 1 Formula of denaturing gradient gel

        DGGE電泳后凝膠于Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)分析、拍照。將每條可看到的電泳帶切割回收,溶膠后作為模板通過PCR反應擴增26S rDNA 片段,純化后與pGM-T Vector進行連接, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。將檢測陽性克隆的樣品送到華大基因公司進行基因序列測定。

        1.3.4 DGGE圖譜分析

        使用Quantity One軟件分析DGGE凝膠圖譜。

        計算多樣性指數(shù)(H)、均勻度指數(shù)(D)、豐富度指數(shù)(R)。

        計算公式:

        多樣性指數(shù)(H)[12]的計算公式:

        H=-∑(ni/N)In(ni/N),E=H/InS,R=S-1/InN。

        式中:ni為單一條帶的峰面積,N為某一泳道所有峰面積,S為某一泳道的總條帶數(shù)。

        1.3.5 系統(tǒng)發(fā)育分析方法

        將測序結(jié)果提交到NCBI中進行比對,通過MEGA 6.0利用Neighbor-Joining法建立26S rDNA片段的系統(tǒng)發(fā)育樹。

        2 結(jié)果及分析

        2.1 提取DNA的電泳分析

        DNA提取后的電泳檢測結(jié)果和PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖見圖1。

        圖1 基因組DNA(左)及PCR(右)電泳圖Fig.1 Genomic DNA (left) and PCR (right) electrophoretogram

        注:JA表示袋裝醬菜,JB表示散裝醬菜,M表示Marker。

        由基因組DNA電泳圖1(左)中可知,JA樣品與JB樣品的DNA條帶無非特異帶,能夠進行PCR擴增反應。 由圖1(右)可知,樣品DNA片段大小約為270 bp。擴增產(chǎn)物條帶清晰,因此可以做DGGE實驗。

        2.2 變性梯度凝膠電泳結(jié)果

        PCR擴增產(chǎn)物 DGGE 凝膠電泳分析結(jié)果見圖2。

        圖2 DGGE 電泳圖譜Fig.2 DGGE electrophoretogram

        由DGGE圖譜可知,凝膠圖譜中條帶的位置、粗細以及亮暗程度有一定的差異。JA樣品有3個條帶,分別是JA-2、JA-1、JA-3,表明JA樣品有3種酵母菌。JB樣品有2個條帶,分別是JB-1、JB-2,表明JB樣品有兩種酵母菌。其中JA-1和JB-1、JA-3和JB-2位置一致,表明兩個樣品中有同種酵母菌。JA-2較粗較亮,說明該種酵母菌含量較高。

        2.3 醬菜微生物26S rDNA片段的DGGE圖譜分析

        2.3.1 醬菜微生物群落結(jié)構(gòu)特征

        使用Quantity One軟件分析DGGE凝膠圖譜可知(見表2),JA樣品與JB樣品的均勻度指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。JA樣品的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)顯著大于JB樣品(P<0.05),表明JA樣品的酵母菌種類較豐富。

        表2 酵母菌微生物群落結(jié)構(gòu)特征Table 2 Structural characteristics of yeast microbial community

        2.3.2 醬菜不同發(fā)酵時間酵母菌類型的聚類分析

        運用Quantity One軟件的“phylogenetic analysis”方式,根據(jù)UWPGA算法對兩種醬菜酵母菌群落結(jié)構(gòu)進行相似性聚類分析。由圖3可知,兩種醬菜樣品的酵母菌群落結(jié)構(gòu)聚于一個大分支。

        圖3 兩種醬菜26S rDNA 片段的DGGE條帶 相似性聚類圖Fig.3 DGGE band similarity clustering map of 26S rDNA fragments of two kinds of pickles

        2.3.3 DGGE回收電泳帶的鑒定

        為了研究發(fā)酵醬菜體系中優(yōu)勢的微生物種類,實驗中回收熒光強度強、不同時間差異的電泳帶,通過基因擴增反應后測定堿基序列,與GenBank 庫序列對比鑒定。發(fā)酵醬菜樣品DGGE條帶序列結(jié)果見表3。

        表3 醬菜酵母菌的DGGE條帶序列結(jié)果Table 3 DGGE band sequencing results of yeasts in pickles

        電泳條帶JA-2、JB-1、JB-2分別與Pichiafermentans(乳源酵母)、Candidatropicalis(熱帶假絲酵母)、Candidatropicalis(熱帶假絲酵母)的菌株相似,相似度約為88%、98%、98%。

        2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

        使用MEGA 6.0軟件利用Neighbor-Joining法建立26S rDNA片段的系統(tǒng)發(fā)育樹,對其進行系統(tǒng)發(fā)育分析,見圖4。

        圖4 醬菜樣品中酵母菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of yeasts in pickle samples

        3 結(jié)論

        本實驗以兩種市售醬菜為研究對象,通過PCR-DGGE方法分析了這兩種醬菜中酵母菌的多樣性。發(fā)現(xiàn)樣品JA比樣品JB的酵母菌種數(shù)大,發(fā)酵醬菜中的酵母菌總共有3個屬,熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)為優(yōu)勢菌種。兩個樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)沒有明顯的差異。2011年,高秀芝等[13]用PCR-DGGE法分析了天源醬園豆醬發(fā)酵過程中微生物多樣性。研究表明,發(fā)酵過程中主要的細菌優(yōu)勢種是地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和未培養(yǎng)明串珠克隆(UnculturedLeuconostocsp. clone),主要的真菌優(yōu)勢種是米曲霉(Aspergillusoryzae)。2014年烏日娜等[14]用PCR-DGGE法分析了東北自然發(fā)酵酸菜中的生物多樣性。結(jié)果表明,酸菜中的真菌種類比較少,細菌種類較多。主要的真菌菌種有漢遜德巴利(Debaryomyceshansenii)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)等。

        培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法二者都可以用來研究發(fā)酵體系微生物的多樣性。培養(yǎng)法是通過配制滿足目的微生物基本生長需求的培養(yǎng)基,使目的微生物在培養(yǎng)基上生長與繁殖的方法,這種方法可能會出現(xiàn)在發(fā)酵體系中大量存在的微生物在培養(yǎng)基上無法正常培養(yǎng)或生長的情況,導致研究結(jié)果出現(xiàn)偏差。因此更多的人選擇工作量小且能夠較真實地反映發(fā)酵體系中微生物多樣性的非培養(yǎng)法[15],即基于PCR的DGGE技術(shù)。2008年, Chang Ho-Won等[16]用PCR-DGGE技術(shù)研究細菌、古細菌和酵母在不同類型泡菜中的發(fā)酵動力學。根據(jù)DGGE的原理,該方法可以分離長度相同但堿基序列不同的DNA片段。 DGGE圖譜中條帶的位置、數(shù)量和亮暗程度可以反映出樣品中微生物多樣性的信息[17]。

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