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        Folin-Ciocalteu比色法測定昭通青花椒總酚含量

        2019-10-17 09:24:28熊汝琴李平王銳
        中國調(diào)味品 2019年10期

        熊汝琴,李平,王銳

        (昭通學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,云南 昭通 657000)

        青花椒(Zanthoxylumschinifolium)為蕓香科(Rutaceae)花椒屬(ZanthoxylumL.)植物青椒的干燥果皮,又名香椒子、崖椒、野椒、青椒、狗椒。因其麻味純正、氣味清香、顏色清爽而在各地菜肴尤其是川菜中廣泛使用,深受消費者喜愛。青花椒不僅是常用調(diào)味品,也是《中華人民共和國藥典》收載的常用中藥材,具有溫中止痛、殺蟲止癢的功能,可用于治療脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、蟲積腹痛、濕疹瘙癢等癥狀[1-3]。青花椒喜光、耐寒、耐旱,對生長環(huán)境的適應(yīng)能力較強,在我國栽培歷史悠久,分布范圍廣泛,四川金陽、重慶江津、貴州、云南等地已經(jīng)把青花椒作為主要的經(jīng)濟作物之一。云南省昭通地區(qū)因其獨特的海拔及光熱條件,非常適合青花椒種植,目前種植面積已超過100萬畝,產(chǎn)量約占全省的60.0%~70.0%。近年來,昭通市高度重視青花椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展,青花椒在種植規(guī)模、管理水平、產(chǎn)品品質(zhì)上具有較大提高。

        目前,大多數(shù)對花椒化學(xué)成分的研究報道主要集中于陜西、甘肅、四川、重慶等全國聞名的花椒種植基地所產(chǎn)花椒,主要以研究揮發(fā)油、酰胺類化合物、生物堿、黃酮等為主[4-11]。近年來,花椒中的酚性成分因具有獨特的藥理活性而受到關(guān)注。研究表明花椒多酚粗提物具有較強的抗氧化能力和清除自由基能力[12,13],在動物實驗中顯示出抗抑郁作用,改善D-半乳糖衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,改善老年癡呆癥狀的作用[14-16]。但是,由于產(chǎn)地的氣候、雨量、日照和土質(zhì)等諸多自然因素的不同,不同產(chǎn)地花椒的化學(xué)組成及含量有很大差異。而昭通青花椒的種植面積雖不斷擴大,但對其化學(xué)成分的系統(tǒng)研究卻鮮有報道,缺乏理論數(shù)據(jù)的支撐,加上臨近四川、重慶等花椒種植基地,使昭通青花椒的市場競爭力較弱,品牌效應(yīng)不高。因此,本文采用Folin-Ciocalteu比色法測定昭通幾個縣區(qū)所產(chǎn)青花椒總酚成分含量,期望增加昭通青花椒的附加值,為青花椒的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        青花椒樣品分別采于昭通市大關(guān)縣、鹽津縣、魯?shù)榭h、永善縣、彝良縣、巧家縣和鎮(zhèn)雄縣。

        Folin-Ciocalteu試劑:AR,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;無水Na2CO3:AR,天津市福晨化學(xué)試劑廠;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品:中國藥品生物制品檢定所,供定量測定用;無水乙醇:AR,成都市聯(lián)合化工試劑研究所;二次蒸餾水。

        1.2 儀器與設(shè)備

        HH-S24型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇儀器廠;SK3200HP型超聲提取器 上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司;YB-150型高速多功能粉碎機 永康市速鋒工貿(mào)有限公司;3111000831型移液器 德國 Eppendorf公司;UV756紫外可見分光光度計 上海奧普勒儀器有限公司。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 供試品溶液的制備

        將昭通各縣區(qū)青花椒粉碎,過30目篩,分別稱取2.0000 g花椒粉,加60%乙醇50 mL,25 ℃超聲提取[17],常溫過濾制得花椒樣液。

        1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        準(zhǔn)確稱取0.1000 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品,蒸餾水溶解定容至100 mL,準(zhǔn)確移取1.0 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50 mL于100 mL容量瓶中,加入60 mL蒸餾水,再加入Folin-Ciocalteu試劑1.00 mL并搖勻,靜置2~3 min,加入10%的Na2CO3溶液5.00 mL后用蒸餾水定容,在25 ℃恒溫水浴鍋中放置反應(yīng)120 min,在765 nm處分別測定吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.3.3 青花椒中總酚含量的測定

        精確吸取0.10 mL花椒樣液,加60 mL蒸餾水,再加入1.00 mL福林酚試劑,搖勻,放置2~3 min后,加入5.00 mL 10% Na2CO3溶液,用蒸餾水定容至100 mL,置于25 ℃恒溫水浴鍋中顯色120 min,于765 nm處測吸光度,按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度,代入公式求總酚含量。

        式中:ω為總酚含量(mg/g);C為沒食子酸質(zhì)量濃度(μg/mL);V為提取液體積(mL);N為稀釋倍數(shù);M為取樣量(g)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 超聲提取時間的選擇

        準(zhǔn)確稱取2.0000 g大關(guān)產(chǎn)青花椒粉末,加入60%50 mL乙醇溶液,于25 ℃分別超聲提取10~80 min(10 min/次),常溫下分別過濾制得花椒樣液,精確吸取0.10 mL樣品液于100 mL容量瓶中,依次加入60 mL蒸餾水,1.00 mL福林酚試劑,搖勻,放置2~3 min,加入5.00 mL 10% Na2CO3溶液后用蒸餾水定容,在25 ℃水浴鍋中顯色120 min后于765 nm處測定吸光度,結(jié)果見表1和圖1。

        圖1 提取時間與吸光度的關(guān)系Fig.1 The relationship between extraction time and absorbance

        由圖1可知,提取時間達60 min后吸光度隨時間增加不明顯,因此選擇60 min作為超聲提取時間。

        2.2 顯色反應(yīng)條件的確定

        2.2.1 Na2CO3溶液用量的確定

        準(zhǔn)確稱取2.0000 g大關(guān)產(chǎn)青花椒粉末,加入60%的乙醇50 mL,于25 ℃超聲提取60 min,常溫下過濾制得花椒樣液。準(zhǔn)確移取0.10 mL花椒樣液于100 mL容量瓶中加入蒸餾水60 mL,再加入福林酚試劑1.00 mL并搖勻,靜置2~3 min,分別加入不同體積的10% Na2CO3溶液,用蒸餾水定容,在25 ℃恒溫水浴鍋中顯色120 min,于765 nm處測吸光度,結(jié)果見表2和圖2。

        表2 Na2CO3溶液用量的確定實驗Table 2 Experiment for determining the dosage of Na2CO3 solution

        圖2 Na2CO3溶液用量與吸光度的關(guān)系Fig.2 The relationship between the dosage of Na2CO3 solution and absorbance

        由圖2可知,當(dāng)10% Na2CO3溶液的體積為5.00 mL時效果最佳,因此確定10% Na2CO3溶液用量為5.00 mL。

        2.2.2 顯色時間的確定

        準(zhǔn)確移取0.10 mL大關(guān)產(chǎn)青花椒樣液,于100 mL容量瓶中,加入60 mL蒸餾水,再加入1.00 mL福林酚試劑并搖勻,靜置2~3 min,加入10%的Na2CO3溶液5.00 mL后用蒸餾水定容,在25 ℃恒溫水浴鍋中放置反應(yīng)20 min后開始,每隔20 min在765 nm處分別測定吸光度,結(jié)果見表3和圖3。

        表3 顯色時間的確定實驗Table 3 Experiment for determining chromogenic time

        圖3 顯色時間與吸光度的關(guān)系Fig.3 The relationship between chromogenic time and absorbance

        由圖3可知,顯色反應(yīng)在120 min后趨于穩(wěn)定,因此選擇顯色反應(yīng)時間為120 min。

        2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        準(zhǔn)確移取1.0 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50 mL于100 mL容量瓶中,加入60 mL蒸餾水,再加入Folin-Ciocalteu試劑1.00 mL并搖勻,靜置2~3 min,加入10%的Na2CO35.00 mL后用蒸餾水定容,在25 ℃恒溫水浴鍋中放置反應(yīng)120 min,在765 nm處測定吸光度,結(jié)果見表4和圖4。

        表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制實驗Table 4 Experiment for drawing standard curve

        圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve

        由圖4可知,沒食子酸濃度在0~5 μg/mL內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好,線性回歸方程y=0.0873x+0.0095,r=0.9991。

        2.4 加標(biāo)回收率實驗

        準(zhǔn)確吸取大關(guān)青花椒樣液0.10 mL,分別加入0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35 mL的1.0 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,按2.3實驗方法測吸光度并計算回收率,結(jié)果見表5。平均回收率為100.1%,表明采用Folin-Ciocalteu比色法測定昭通青花椒總酚含量具有良好的精密度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

        表5 加標(biāo)回收率實驗Table 5 Recovery rate experiment

        2.5 昭通青花椒總酚含量測定

        分別取昭通市大關(guān)、鹽津、魯?shù)椤⒂郎?、彝良、巧家、?zhèn)雄幾個縣區(qū)所產(chǎn)青花椒樣品,按前述2.1制取樣品液,按2.2確定實驗條件進行顯色反應(yīng)后測定吸光度值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總酚含量,平行測定5份,計算結(jié)果見表6。

        表6 昭通青花椒總酚含量測定Table 6 Determination of total phenols in Zhaotong Zanthoxylum schinifolium

        鎮(zhèn)雄縣青花椒總酚平均含量為52.57 mg/g,RSD為0.43%;彝良縣青花椒總酚平均含量為53.54 mg/g,RSD為0.90%;永善縣青花椒總酚平均含量為53.96 mg/g,RSD為0.17%;巧家縣青花椒總酚平均含量為54.25 mg/g,RSD為0.80%;魯?shù)榭h青花椒總酚平均含量為57.12 mg/g,RSD為0.61%;鹽津縣青花椒總酚平均含量為58.77 mg/g,RSD為0.54%;大關(guān)縣青花椒總酚平均含量為62.07 mg/g,RSD為0.92%;重復(fù)性較好。

        3 結(jié)論

        花椒中的酚性成分具有多種重要生理作用,本文以60%乙醇溶液在25 ℃超聲1 h提取昭通青花椒酚性成分。采用Folin-Ciocalteu比色法,確定10% Na2CO3溶液用量為5.00 mL,F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑用量為1.00 mL,顯色時間為120 min,以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,y=0.0873x+0.0095,r=0.9991,濃度在0~5 μg/mL內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。按以上實驗條件測得昭通七縣區(qū)青花椒總酚含量范圍為52.57~62.07 mg/g,平均總酚含量為56.04 mg/g,回收率為100.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.39%。結(jié)果表明該方法操作簡便,重復(fù)性好,檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可為昭通青花椒的品質(zhì)研究提供實驗參考。

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