張艷芳，饒遠(yuǎn)，孟廣超,2，王選年

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院生物技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450001)

醬油是傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，具有悠久的歷史，深受我國(guó)、日韓和東南亞各國(guó)人民的喜愛(ài)[1,2]。米曲霉是醬油釀造中最重要的微生物，菌絲生長(zhǎng)迅速，成熟后呈現(xiàn)黃綠色孢子，具有優(yōu)良的胞外酶系分泌和食品安全性[3,4]，主要產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶等[5]。米曲霉蛋白酶根據(jù)酶切方式可分為內(nèi)切酶和外切酶兩大類，其中內(nèi)切酶包括中性、堿性、酸性蛋白酶，外切酶包括羧肽酶和氨肽酶[6-8]。氨肽酶是一類可以從肽鏈N端水解相應(yīng)的疏水氨基酸的外肽酶[9]，在醬油發(fā)酵中當(dāng)氨肽酶與蛋白酶結(jié)合在一起使用時(shí)，可進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)分子的水解程度，從而產(chǎn)生更多的小肽和種類豐富的氨基酸，可提高醬油口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[10-12]。但在發(fā)酵過(guò)程中，經(jīng)高濃度鹽水浸泡后醪中殘存的酶活力有明顯下降[13,14]，鹽對(duì)蛋白酶及淀粉酶的影響已有研究，但對(duì)于氨肽酶的影響還未深入開(kāi)展。

本試驗(yàn)討論了制曲過(guò)程中NaCl濃度對(duì)氨肽酶活力的影響，并對(duì)其耐鹽性進(jìn)行了探討，旨在研究醬油生產(chǎn)過(guò)程中NaCl濃度對(duì)米曲霉所產(chǎn)氨肽酶酶活力的影響，并為后期深入討論NaCl濃度、米曲霉產(chǎn)酶特性與醬油發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味變化的關(guān)系提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

Aspergillusoryzae：本實(shí)驗(yàn)室保存，斜面4 ℃保藏。

1.1.2 主要材料與試劑

馬鈴薯、麩皮、豆粕：市售，購(gòu)于本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

葡萄糖、NaCl、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、三羥甲基氨基甲烷、HCl：均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；瓊脂：生化試劑，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；L-亮氨酸對(duì)硝基苯胺：分析純，購(gòu)自Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250-2型恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；HVE-FO型高壓蒸汽滅菌鍋 金壇市恒豐儀器廠；SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái) 寧波新芝生物科技有限公司；PL403型電子天平 梅特勒-托利多公司；3110型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；B-260型水浴鍋 上海醫(yī)療器械五廠。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑的配制方法

磷酸緩沖液的制備(pH 7.5)：使用電子天平準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉6.02 g和磷酸二氫鈉0.5 g加入1000 mL容量瓶中，然后加蒸餾水定容至1000 mL。

1.3.2 培養(yǎng)基的配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)的配制：將500 g削皮、干凈的土豆切碎置于1000 mL大燒杯中，補(bǔ)充蒸餾水至1000 mL，電爐加熱并維持煮沸狀態(tài)20 min，4層紗布過(guò)濾，用蒸餾水將濾液補(bǔ)充至1000 mL，加入葡萄糖和瓊脂粉各20 g煮沸直至全部溶解，分裝于三角瓶中，于121 ℃滅菌20 min[15]。

麩皮豆粕培養(yǎng)基的制備：準(zhǔn)確稱量豆粕20 g、麩皮80 g，添加1倍質(zhì)量含不同鹽濃度的水混勻?；靹蚝蠓盅b30 g于250 mL的三角瓶中，三角瓶中的鹽濃度梯度為0、1%、3%、5%、7%(g/dL)，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，滅菌后搖瓶，保持原料處于疏松的狀態(tài)[16]。

1.3.3 菌種的培養(yǎng)

1.3.3.1 斜面培養(yǎng)

將冰箱中4 ℃冷凍保藏的米曲霉菌種以無(wú)菌操作的方式接種于新制備的PDA斜面培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，備用。

1.3.3.2 米曲霉的活化培養(yǎng)

將斜面上培養(yǎng)的成熟的米曲霉用接種環(huán)以無(wú)菌操作方式接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.3.3.3 制備孢子懸液

取生長(zhǎng)良好的試管斜面菌種，用磷酸鹽緩沖液輕輕地將培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的米曲霉洗脫至裝有玻璃珠的150 mL無(wú)菌三角瓶中，震蕩20 min 后用雙層紗布過(guò)濾，然后使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整孢子濃度為107個(gè)/mL[17]。

1.3.3.4 米曲霉的制曲培養(yǎng)

取適量孢子懸液以無(wú)菌操作方式按照3%(mL/100 g)的接種量接種于麩皮豆粕固體培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)72 h。

1.3.4 氨肽酶粗酶液的制備

取5 g于37 ℃培養(yǎng)后的固體干曲，按照1∶20 (g/mL)加入0.1 mol/L pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液，于40 ℃水浴中，間歇攪拌，浸提1 h，用4層紗布過(guò)濾后即可獲得氨肽酶粗酶液[18]。

1.3.5 氨肽酶酶活力的測(cè)定

氨肽酶活力的測(cè)定采用亮氨酸對(duì)硝基苯胺法，以亮氨酸氨肽酶酶活計(jì)。在試管中加入2 mL 0.1 mol/L pH 7.5的磷酸鹽緩沖液，然后向緩沖液中加入1 mL經(jīng)過(guò)稀釋一定倍數(shù)的米曲霉氨肽酶粗酶液，最后向緩沖液中加入1 mL的L-亮氨酸對(duì)硝基苯胺，輕輕搖晃試管使其充分混合均勻，于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)10 min，立即取出冰浴并于405 nm處測(cè)量吸光值[19,20]。

計(jì)算公式：X=105.7×4×N×Y/10000。

式中：X為氨肽酶粗酶液的酶活力；N為405 nm處測(cè)定得到的吸光值；Y為粗酶液的稀釋倍數(shù)。

氨肽酶酶活力的定義：將50 ℃反應(yīng)條件下，每分鐘催化L-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯胺所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同NaCl濃度下培養(yǎng)對(duì)米曲霉生長(zhǎng)情況的影響

在37 ℃下將米曲霉在含有不同NaCl濃度(0、1%、3%、5%、7%，g/100 g)的麩皮豆粕固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，米曲霉生長(zhǎng)情況見(jiàn)表1。

表1 米曲霉菌落在不同NaCl濃度固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Table 1 The growth situation of Aspergillus oryzae on solid medium with different NaCl concentration

由表1可知，培養(yǎng)基中添加NaCl對(duì)米曲霉的生長(zhǎng)有一定的影響。在麩皮豆粕固體培養(yǎng)基中NaCl濃度由0增加到3%的過(guò)程中，米曲霉的生長(zhǎng)速度隨著鹽濃度增加而提高。在NaCl濃度為3%時(shí)，米曲霉培養(yǎng)72 h出現(xiàn)大量綠色孢子；而NaCl濃度為0時(shí)，需培養(yǎng)84 h才有大量綠色孢子產(chǎn)生，由此推測(cè)培養(yǎng)基中NaCl濃度為3%時(shí)，對(duì)米曲霉的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶能力有一定程度的增強(qiáng)。當(dāng)NaCl濃度超過(guò)3%時(shí)，米曲霉生長(zhǎng)又會(huì)變得緩慢，即當(dāng)NaCl濃度大于3%時(shí)，隨著鹽濃度的不斷升高，對(duì)米曲霉的生長(zhǎng)又表現(xiàn)出一定的抑制作用。

2.2 不同NaCl濃度培養(yǎng)對(duì)米曲霉產(chǎn)氨肽酶能力的影響

在37 ℃下將米曲霉在含有不同NaCl濃度(0、1%、3%、5%、7%，g/100 g)麩皮豆粕固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，在不含NaCl的磷酸鹽緩沖液中分別測(cè)定培養(yǎng)48，72，96 h后培養(yǎng)基中氨肽酶的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同鹽濃度培養(yǎng)對(duì)米曲霉產(chǎn)氨肽酶能力的影響Fig.1 The effects of different NaCl concentration on the aminopeptidase capacity produced by Aspergillus oryzae

由圖1可知，氨肽酶活力在培養(yǎng)72 h后大幅提升，說(shuō)明米曲霉在培養(yǎng)72 h后產(chǎn)酶能力最高。在培養(yǎng)基NaCl濃度為0～3%時(shí)，隨著鹽濃度的不斷增加，氨肽酶活力不斷提升，3%時(shí)達(dá)到最高，培養(yǎng)48 h時(shí)酶活力為22.498 U/mL，培養(yǎng)72 h時(shí)酶活力為28.432 U/mL，培養(yǎng)96 h時(shí)酶活力為27.014 U/mL，相較于未添加NaCl培養(yǎng)的米曲霉的氨肽酶活力分別提高了4.98%、11.49%和7.48%。之后，隨著NaCl濃度的繼續(xù)增加，氨肽酶活力出現(xiàn)下降趨勢(shì)。由此說(shuō)明，在含有3% NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對(duì)米曲霉產(chǎn)氨肽酶有一定的促進(jìn)作用，在培養(yǎng)72 h時(shí)產(chǎn)酶能力最高。

2.3 不同NaCl濃度對(duì)米曲霉產(chǎn)氨肽酶酶活力的影響

在37 ℃下將米曲霉在不含NaCl的麩皮豆粕固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，分別培養(yǎng)48，72，96 h后，在含不同NaCl濃度(0、5%、10%、15%、20%、25%，g/dL)的磷酸鹽緩沖液中分別測(cè)定培養(yǎng)基中氨肽酶的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同鹽濃度對(duì)米曲霉產(chǎn)氨肽酶酶活力的影響Fig.2 The effects of different NaCl concentration on the aminopeptidase ability produced by Aspergillus oryzae

由圖2可知，氨肽酶活力在培養(yǎng)72 h后最高，同樣說(shuō)明米曲霉在培養(yǎng)72 h后產(chǎn)酶能力最高。在測(cè)定氨肽酶活力的反應(yīng)體系中，磷酸鹽緩沖溶液中NaCl濃度為0～10%時(shí)，隨著鹽濃度的不斷增加，氨肽酶活力不斷提升，10%時(shí)達(dá)到最高，培養(yǎng)48 h時(shí)酶活力為23.186 U/mL，培養(yǎng)72 h時(shí)酶活力為26.258 U/mL，培養(yǎng)96 h時(shí)酶活力為25.878 U/mL，相較于未添加NaCl時(shí)測(cè)定的米曲霉的氨肽酶活力分別提高了8.19%、5.29%和6.80%。但是，隨著NaCl濃度的繼續(xù)增加，氨肽酶活力出現(xiàn)下降趨勢(shì)，NaCl濃度為25%時(shí)對(duì)氨肽酶酶活力有明顯的抑制作用，氨肽酶活力均低于緩沖溶液不含NaCl時(shí)，分別下降了2.96%、6.51%、3.03%。由此說(shuō)明，在含有10% NaCl的環(huán)境中，對(duì)米曲霉氨肽酶活力有一定的促進(jìn)作用，NaCl高于15%之后，對(duì)氨肽酶的活力有一定的抑制作用。

2.4 不同鹽濃度馴化對(duì)米曲霉氨肽酶耐鹽性的影響

在37 ℃下將米曲霉在含不同濃度NaCl(0、1%、3%、5%、7%，g/100 g)的麩皮豆粕固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h后，在含不同NaCl濃度(0、5%、10%、15%、20%、25%，g/dL)的磷酸鹽緩沖液中分別測(cè)定培養(yǎng)基中氨肽酶的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同鹽濃度培養(yǎng)72 h后對(duì)米曲霉氨肽酶耐鹽性的影響Fig.3 The effects of different NaCl concentration on the salt tolerance of aminopeptidase produced by Aspergillus oryzae after culturing for 72 h

由圖3可知，未添加NaCl馴化培養(yǎng)時(shí)，氨肽酶活力在10% NaCl溶液中最高，之后隨著鹽濃度的增加呈下降趨勢(shì)。但在添加一定濃度的NaCl馴化培養(yǎng)后，氨肽酶活力均在鹽濃度15%時(shí)達(dá)到最高。在1%和3% NaCl濃度下培養(yǎng)馴化的米曲霉氨肽酶活力在0～15%濃度的NaCl環(huán)境中均高于未經(jīng)馴化的米曲霉氨肽酶活力，其中3% NaCl濃度下馴化培養(yǎng)后的米曲霉氨肽酶活力在15% NaCl濃度環(huán)境中最高，為29.884 U/mL，較未經(jīng)馴化培養(yǎng)的酶活力提高了6.99%。與未經(jīng)NaCl馴化培養(yǎng)相比較，培養(yǎng)72 h的米曲霉氨肽酶最大酶活力為在10% NaCl環(huán)境中，酶活力為26.258 U/mL，由此可見(jiàn)，經(jīng)3% NaCl馴化培養(yǎng)后，米曲霉氨肽酶最大酶活力提高了13.81%，鹽濃度提高了5%。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，NaCl對(duì)米曲霉的生長(zhǎng)、米曲霉產(chǎn)氨肽酶能力以及米曲霉產(chǎn)氨肽酶活力都有一定影響。在含有3% NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對(duì)米曲霉產(chǎn)氨肽酶的能力有一定的促進(jìn)作用，但在超過(guò)5% NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對(duì)米曲霉產(chǎn)氨肽酶能力有明顯的抑制作用。在磷酸鹽緩沖溶液中NaCl濃度為0～10%時(shí)，隨著鹽濃度的不斷增加，對(duì)氨肽酶活力有一定的促進(jìn)作用，10%時(shí)達(dá)到最高，培養(yǎng)72 h酶活力為26.258 U/mL，較未添加NaCl時(shí)酶活力提高了5.29%，超過(guò)10% NaCl濃度對(duì)氨肽酶活力有明顯抑制作用。但經(jīng)過(guò)在含NaCl培養(yǎng)基上進(jìn)行馴化培養(yǎng)后，米曲霉氨肽酶的耐鹽性及活力都得到一定的提升。3% NaCl濃度下馴化培養(yǎng)后的米曲霉氨肽酶活力在15% NaCl濃度環(huán)境中最高，為29.884 U/mL，與未經(jīng)NaCl馴化培養(yǎng)相比較，米曲霉氨肽酶最大酶活力提高了13.81%，鹽濃度提高了5%。因此，在醬油生產(chǎn)中，合理控制制曲、發(fā)酵階段的NaCl濃度對(duì)提高氨肽酶活力，增強(qiáng)醬油產(chǎn)品風(fēng)味將起到積極作用。