馬永強(qiáng)，鄧倩，范洪臣，李鳳

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076)

啤酒是世界上最受歡迎的含酒精飲料[1]。通常由麥芽、酵母、酒花和水4種原料釀造[2]。啤酒營(yíng)養(yǎng)豐富，其組成成分包括各類(lèi)醇、醛、酸、酮和酯[3-5]。小麥啤酒是啤酒的重要分類(lèi)，區(qū)別于拉格啤酒釀造，是在釀造原料中添加小麥，采用艾爾酵母，較高的發(fā)酵溫度(18～25 ℃)，因此其發(fā)酵液具有不同于其他種類(lèi)啤酒特殊的水果香氣和酸味，尤其是酸味給發(fā)酵液帶來(lái)了重要作用。發(fā)酵液的酸味主要由無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸組成，有機(jī)酸是發(fā)酵液中存在的重要化合物，它不僅對(duì)啤酒的酸味有重大影響，而且還具有其他風(fēng)味特征，如苦味或咸味[6]。研究表明，啤酒中含有醋酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、富馬酸、甲酸鹽、乳酸、琥珀酸等多種有機(jī)酸，這些有機(jī)酸在不同類(lèi)型的發(fā)酵液中含量差異很大[7]。此外，有機(jī)酸也會(huì)影響發(fā)酵液的酸堿度，這會(huì)影響發(fā)酵液的質(zhì)量，如風(fēng)味穩(wěn)定性[8]。Coote和Kirsop以及Mackenzie和Kenny都發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸的生成是導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程中pH值下降的重要因素[9]。影響發(fā)酵液的酸味及其他風(fēng)味特征，因此，控制啤酒中有機(jī)酸的含量是十分重要的。Li Hong和Liu Fang[10]研究了拉格啤酒發(fā)酵產(chǎn)生的7種有機(jī)酸規(guī)律以及對(duì)啤酒風(fēng)味的影響。

有機(jī)酸的種類(lèi)和含量對(duì)發(fā)酵液有機(jī)酸的研究起著重要作用，但發(fā)酵液由于所含成分與拉格啤酒、醋等發(fā)酵產(chǎn)物成分千差萬(wàn)別，因此在樣品的前處理、測(cè)量條件上都會(huì)不同。有機(jī)酸測(cè)定的方法較多，包括電位滴定法[11]、分光光度法、氣相色譜法、離子色譜法、高效液相色譜法[12]等。上述方法中，液相色譜法最靈敏和準(zhǔn)確并且被廣泛運(yùn)用。本研究通過(guò)優(yōu)化反相C18柱的色譜條件和預(yù)處理?xiàng)l件，擬建立一種操作簡(jiǎn)單、方便，且具有靈敏性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性的發(fā)酵液中有機(jī)酸的測(cè)定方法，對(duì)發(fā)酵液前處理的優(yōu)化形成一套檢測(cè)有機(jī)酸的體系，使數(shù)據(jù)更精準(zhǔn)，也可以為其他發(fā)酵食品提供借鑒方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1200 高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent 公司；Tiank C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱、預(yù)處理柱Superclean C18(500 mg/6 mL) 美國(guó)菲羅門(mén)公司；SHE-111型超聲波清洗器 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；電子天平 Sartorinls儀器(北京)有限公司；高速冷凍離心機(jī) 上海歡奧科技有限公司。

1.2 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：檸檬酸、琥珀酸、乳酸、蘋(píng)果酸、草酸、酒石酸、冰醋酸，美國(guó)Sigma公司；發(fā)酵液：保拉納酵母型發(fā)酵液，德國(guó)保拉納啤酒(北京)有限責(zé)任公司；試劑：H3PO4、HCl、NH3·H2O、NaH2PO4、KH2PO4、(NH4)2HPO4、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、乙酸鋅、三氯乙酸：AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的配制參照GB 5009.157—2016中方法。酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、檸檬酸、草酸、冰醋酸及琥珀酸，取表1中濃度各5 mL，用0.02 mol/L的磷酸定容至100 mL容量瓶中。

表1 有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制參照濃度Table 1 Reference concentration of mixed standard solution of organic acids

1.3.2 樣品前處理

取5 mL啤酒樣品于100 mL 容量瓶中，分別加入2 mL 10.6%亞鐵氰化鉀和2 mL 30%硫酸鋅溶液，超純水定容至100 mL。搖勻后靜止10 min后，用45000 r/min離心機(jī)分離20 min。取上清液加入用甲醇活化好的Superclean C18小柱中，使樣品溶液緩慢流過(guò)小柱以除去色素等干擾物，棄去最初2 mL流出液，收集樣液。

1.3.3 測(cè)定條件優(yōu)化1.3.3.1 不同前處理?xiàng)l件

a.蛋白沉淀劑的選擇

參考錢(qián)國(guó)英[13]、儲(chǔ)黎娟等[14]及余永健等[15]關(guān)于食醋有機(jī)酸的測(cè)定，分別采用亞鐵氰化鉀-乙酸鋅,亞鐵氰化鉀-硫酸鋅及無(wú)水乙醇進(jìn)行前處理，余下條件不變，觀察其有機(jī)酸分離效果。

b.分離方法的選擇

根據(jù)王奇等[16]的食醋有機(jī)酸前處理方法，啤酒無(wú)法直接在蛋白沉淀劑處理后完全沉淀、分離、過(guò)濾，所以參考張奇等[17]的離心機(jī)分離法，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室設(shè)備設(shè)定為轉(zhuǎn)速45000 r/min，時(shí)間20 min。

c.固相萃取小柱的對(duì)比選擇

選擇Superclean C18小柱、舊Superclean C18小柱、活性炭小柱分別采用甲醇進(jìn)行活化，然后用超純水將甲醇洗凈[18]，最后將已通過(guò)前處理的樣品溶液緩慢流過(guò)小柱以除去色素等干擾物，棄去最初流出的2 mL，收集其后的流出液在確定的最佳色譜條件下進(jìn)樣分析，考察不同固相萃取小柱對(duì)不同酸度發(fā)酵液有機(jī)酸的高效液相色譜圖的影響，確定最佳的固相萃取小柱。

1.3.3.2 不同流動(dòng)相的選擇

選擇NaH2PO4、KH2PO4、H3PO43種緩沖液為流動(dòng)相，固定其濃度 0.02 mol/L、pH 2.7、流速0.6 mL/min、柱溫 37 ℃，分離7種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，得出最優(yōu)緩沖溶液后，再分別固定余下條件，選取0.01,0.02,0.03 mol/L 3種不同濃度的緩沖液，調(diào)節(jié) pH 至 2.3,2.5,2.7,2.9，3.1，研究不同緩沖溶液種類(lèi)、濃度及pH對(duì)有機(jī)酸分離效果的影響。

1.3.3.3 柱溫的選擇

固定其他條件，改變色譜柱溫度為30,37,40 ℃，研究柱溫對(duì)有機(jī)酸分離效果的影響。

1.3.3.4 流速的選擇

固定其他條件，改變流動(dòng)相的流速為 0.425,0.6,0.7,0.8,0.9 mL/min 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究不同流速對(duì)有機(jī)酸分離效果的影響。

1.3.3.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

固定其他條件，在205,210,215 nm 波長(zhǎng)對(duì)7種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行HPLC測(cè)定，研究其有機(jī)酸保留時(shí)間及分離效果。

1.3.3.6 HPLC測(cè)定

前處理后進(jìn)行測(cè)定，磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.02 mol/L，pH為2.7，再經(jīng) 0.45 μm混纖-水系微孔濾膜抽真空過(guò)濾，超聲波脫氣后備用[19]。設(shè)定流速為0.6 mL/min，柱溫為37 ℃，進(jìn)樣體積為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，測(cè)定時(shí)間為30 min進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.7 有機(jī)酸分析的方法學(xué)評(píng)價(jià)

a.線性關(guān)系考察

以峰面積對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)，同時(shí)以信噪比 S/N=3對(duì)應(yīng)的濃度確定各有機(jī)酸的檢出限。

b.精密度試驗(yàn)

為了確定分析方法的精密度，按選定的色譜條件，12 h內(nèi)連續(xù) 5 次對(duì)同一混合標(biāo)樣進(jìn)行 HPLC 分析，測(cè)定各有機(jī)酸的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算其精密度(以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 表示)。

c.準(zhǔn)確度試驗(yàn)

驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，進(jìn)行回收率試驗(yàn)。對(duì)混合標(biāo)樣進(jìn)行 HPLC 分析，根據(jù)樣品的含量和測(cè)定值計(jì)算回收率。

d.重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品 5 份(5 mL)，分別按優(yōu)化的預(yù)處理方法處理樣品，在最佳色譜條件下測(cè)定各種有機(jī)酸，計(jì)算 RSD。

e.穩(wěn)定性試驗(yàn)

取 1 份樣品，分別在制樣后 0,4,8,12,24 h最佳色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定各有機(jī)酸的濃度，計(jì)算 RSD，考察樣品的穩(wěn)定性。

2 分析與討論

2.1 發(fā)酵液前處理的選擇

2.1.1 蛋白沉淀劑的選擇

不同蛋白沉淀劑前處理的發(fā)酵液樣品有機(jī)酸分離效果見(jiàn)圖1。

圖1 不同蛋白沉淀劑前處理的發(fā)酵液樣品有機(jī)酸分離效果圖Fig.1 Separation effect diagrams of organic acids from fermentation broth samples pretreated with different protein precipitators

由圖1可知，用無(wú)水乙醇沉淀蛋白時(shí)，樣品的有機(jī)酸響應(yīng)值很低，可能醇沉的蛋白對(duì)有機(jī)酸有吸附作用，有機(jī)酸含量降低。亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀蛋白后測(cè)得的有機(jī)酸含量也偏低，亞鐵氰化鉀-硫酸鋅沉淀蛋白后測(cè)得的有機(jī)酸響應(yīng)值較高，推測(cè)由蛋白沉淀吸附的有機(jī)酸損失量較少，因此選用亞鐵氰化鉀-硫酸鋅作為沉淀發(fā)酵液的蛋白質(zhì)沉淀劑。

2.1.2 固相萃取小柱的對(duì)比選擇

在發(fā)酵液有機(jī)酸測(cè)定中，蛋白質(zhì)去除后，其糖類(lèi)和色素會(huì)干擾測(cè)定和污染色譜柱。近年來(lái)固相萃取技術(shù)已較多地用于基體復(fù)雜的樣品，同時(shí)活性炭具有較強(qiáng)的吸附作用，也能夠吸附各種有機(jī)物和色素，本實(shí)驗(yàn)考察了固相萃取小柱和活性炭對(duì)發(fā)酵液預(yù)處理后的分離效果，見(jiàn)圖2。

圖2 不同固相萃取小柱的有機(jī)酸發(fā)酵液樣品分離效果圖Fig.2 Separation effect diagrams of organic acids from fermentation broth samples by different solid-phase extraction columns

由圖2可知，經(jīng)活性炭處理的樣品，有機(jī)酸消失，有些雜質(zhì)沒(méi)有去除形成了拖尾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C18固相萃取柱非常有效，處理后樣品無(wú)色透明，適用于液相色譜分析。為了降低成本，固相小柱經(jīng)洗脫后，與新柱相比有機(jī)酸含量有較大差別，不建議重新回收使用。因此選用C18固相萃取小柱作為蛋白質(zhì)沉淀劑后發(fā)酵液的前處理手段。

2.2 流動(dòng)相種類(lèi)的選擇

鹽的種類(lèi)不同導(dǎo)致流動(dòng)相的離子強(qiáng)度也不同，進(jìn)而對(duì)色譜峰的峰形有顯著影響[20]。 同時(shí)，磷酸鹽緩沖溶液是最典型和最合適的洗脫液，在紫外區(qū)幾乎無(wú)吸收[21]。比較KH2PO4、NaH2PO4和H3PO4作為流動(dòng)相的分離效果，固定流動(dòng)相濃度為0.02 mol/L，流速為0.6 mL/min，柱溫為37 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，對(duì)有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。

圖3 不同流動(dòng)相的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品分離效果圖Fig.3 Separation effect diagrams of organic acid standard samples with different mobile phases

由圖3可知，以KH2PO4作流動(dòng)相，7種有機(jī)酸分離度較差，峰形重疊；以NaH2PO4為流動(dòng)相，有機(jī)酸的分離度不佳，且峰形有拖尾現(xiàn)象；以H3PO4作流動(dòng)相分析效果最好，各酸的分離度和峰形均滿足分離需求，7種有機(jī)酸在30 min內(nèi)出峰完畢，綜合考慮，選擇H3PO4為流動(dòng)相緩沖鹽。

2.3 流動(dòng)相濃度的選擇

流動(dòng)相濃度越高，待測(cè)有機(jī)酸的存在形式越穩(wěn)定，但濃度超過(guò)一定范圍時(shí)，隨著離子強(qiáng)度增大，有機(jī)酸分離不良，影響泵和柱的壽命，增加流動(dòng)相的背景吸收，靈敏度下降[22]。本實(shí)驗(yàn)考察3種不同濃度(0.01,0.02,0.03 mol/L)H3PO4流動(dòng)相對(duì)各種有機(jī)酸保留時(shí)間及分離效果的影響。

圖4 不同濃度流動(dòng)相的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品分離效果圖Fig.4 Separation effect diagrams of organic acid standard samples with different concentration of mobile phases

由圖4可知，H3PO4的濃度為0.01 mol/L 時(shí)，有機(jī)酸的分離效果不好；H3PO4的濃度為0.02 mol/L時(shí)，有機(jī)酸均能得到分離，且不影響分離效果?？紤]到上述效果，本實(shí)驗(yàn)使用0.02 mol/L H3PO4溶液作為流動(dòng)相。

2.4 流動(dòng)相pH的選擇

有機(jī)酸均為弱酸，流動(dòng)相的pH 影響樣品的離子化狀態(tài)，提高H+濃度，有機(jī)酸解離平衡則傾向于分子態(tài)，可增加有機(jī)酸的保留時(shí)間，因此由于分配系數(shù)不同有機(jī)酸被分離。從色譜柱填料本身來(lái)看，在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿條件下不穩(wěn)定，硅膠基體和鍵合相受到破壞，本色譜柱的pH為2.7左右，而pH>3 時(shí)，分離效果不佳。以0.02 mol/L的H3PO4作為流動(dòng)相，用HCl調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值分別為2.4，2.7，3.0，分析pH對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中有機(jī)酸分離效果的影響。

圖5 不同pH流動(dòng)相的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品分離效果圖Fig.5 Separation effect diagrams of organic acid standard samples of mobile phases with different pH values

由圖5可知，pH對(duì)分離效果有顯著影響，pH為3.0時(shí)有機(jī)酸分離不佳，pH為2.4時(shí)有機(jī)酸峰面積明顯小于其他兩組，只有當(dāng)pH為2.7時(shí)7種有機(jī)酸分離效果最佳，則選擇pH為2.7。

2.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

圖6 不同檢測(cè)波長(zhǎng)的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品分離效果圖Fig.6 Separation effect diagrams of organic acid standard samples at different detection wavelengths

選用205，210，215 nm 3種波長(zhǎng)進(jìn)行了檢測(cè)，分析混標(biāo)測(cè)定后的圖譜(見(jiàn)圖6)：7種有機(jī)酸的吸收強(qiáng)度隨著波長(zhǎng)變大而呈下降趨勢(shì)，波長(zhǎng)205 nm時(shí)各有機(jī)酸的吸收強(qiáng)度高，但是基線噪音大；波長(zhǎng)215 nm時(shí)有機(jī)酸的吸收強(qiáng)度弱；波長(zhǎng)210 nm時(shí)每種有機(jī)酸的吸收強(qiáng)度高，基線噪聲的影響小。Morales研究表明一元有機(jī)酸在 205～215 nm 處有吸收帶；二元酸及多元酸中吸收峰也在210 nm 附近。本實(shí)驗(yàn)與Morales的研究結(jié)果一致，故采用210 nm 波長(zhǎng)進(jìn)行有機(jī)酸的檢測(cè)。

2.6 柱溫的選擇

色譜理論認(rèn)為柱溫是影響柱效和分離度的主要因素[23]，柱溫升高可使保留時(shí)間減小，但柱溫過(guò)高不利于有機(jī)酸的分離同時(shí)影響色譜柱的使用壽命。 固定其他條件，調(diào)整柱溫為31,34,37,40 ℃，以研究柱溫對(duì)有機(jī)酸分離的影響，見(jiàn)圖7。

圖7 不同柱溫的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品分離效果圖Fig.7 Separation effect diagrams of organic acid standard samples at different column temperatures

由圖7可知，31 ℃時(shí)有機(jī)酸分離不佳，各有機(jī)酸的保留時(shí)間隨柱溫的升高而降低。柱溫為40 ℃時(shí)，部分有機(jī)酸不能完全分離?？紤]到有機(jī)酸的分離度，色譜柱溫度定為37 ℃。

2.7 流速的選擇

在色譜分離時(shí)，流速太快，柱壓高，不利于色譜柱的保護(hù)和長(zhǎng)期使用；流速太慢，有機(jī)酸的保留時(shí)間延長(zhǎng)，容易引起峰值變形和拖尾。合適的流速有利于有機(jī)酸的分離，本實(shí)驗(yàn)采用0.425,0.6,0.7,0.8,0.9 mL/min考察對(duì)有機(jī)酸分離的效果。

由圖8可知，0.425 mL/min時(shí)色譜峰出現(xiàn)變形和拖尾現(xiàn)象，而0.9 mL/min時(shí)柱壓過(guò)大，綜合考慮，采用流速0.6 mL/min。

圖8 不同流速的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品分離效果圖Fig.8 Separation effect diagrams of organic acid standard samples at different flow rates

2.8 有機(jī)酸 HPLC 分析方法的驗(yàn)證結(jié)果

2.8.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

在最佳色譜條件下分析7種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，并使用峰面積-濃度曲線來(lái)量化每種有機(jī)酸的峰面積-濃度曲線。得到7 種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)方程、相關(guān)系數(shù)及最低檢出限，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性參數(shù)Table 2 Linear parameters of organic acid standard curves

由表2可知，有機(jī)酸的峰面積與濃度之間的線性關(guān)系良好，線性范圍寬，檢出限低，表明該方法的靈敏度較高。7種有機(jī)酸單標(biāo)出峰時(shí)間表見(jiàn)表3。

表3 7種有機(jī)酸單標(biāo)出峰時(shí)間表Table 3 Single-labeled peak time schedule for seven organic acids

2.8.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

表4 有機(jī)酸分析方法的精密度(n=5)Table 4 Precision of analytical methods for organic acids(n=5)

(b)峰面積(mAU)

由表4可知，各有機(jī)酸保留時(shí)間的 RSD 為0.01%～0.04%，峰面積的RSD 為 0.00%～0.05%，表明該方法的精密度較好。

2.8.3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表4中有機(jī)酸峰面積的平均值，通過(guò)表2中線性關(guān)系的回歸方程計(jì)算相應(yīng)的有機(jī)酸含量，再與標(biāo)準(zhǔn)樣品的原始濃度進(jìn)行對(duì)比，得出回收率為83%，見(jiàn)表5。

表5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of accuracy experiment

由表5可知，本實(shí)驗(yàn)有機(jī)酸混標(biāo)回收率為83%，準(zhǔn)確度較高。

2.8.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

同一發(fā)酵液樣品在相同處理?xiàng)l件下分5次(時(shí)間間距不超過(guò)40 min)測(cè)定得出的結(jié)果見(jiàn)圖9。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果有機(jī)酸峰面積及其對(duì)應(yīng)濃度數(shù)據(jù)分析見(jiàn)表6。

圖9 重復(fù)性試驗(yàn)有機(jī)酸分離效果圖Fig.9 Separation effect diagrams of organic acids in repetitive experiment

測(cè)定次數(shù)蘋(píng)果酸草酸琥珀酸酒石酸檸檬酸乳酸冰醋酸1204.45166.65174.5093.8343.27189.81141.582200.95155.68183.9394.0140.02194.81148.243170.41126.53171.0293.5652.98174.01150.974189.99127.15184.78106.0254.04192.00161.545204.55186.97169.0195.9843.57178.97145.89均值194.07152.60176.6596.6846.78185.92149.64標(biāo)準(zhǔn)差14.5026.067.315.316.318.967.45RSD(%)0.070.170.040.050.130.050.05

(b)有機(jī)酸含量(mg/mL)

由表6可知，各有機(jī)酸峰面積的RSD為0.04%～0.17%，有機(jī)酸含量的RSD 為 0.01%～0.37%。表明該方法的重復(fù)性較好。

2.8.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

同一發(fā)酵液樣品在相同處理?xiàng)l件下分5次，測(cè)定時(shí)間分別為0,4,8,12,24 h測(cè)定得出的結(jié)果見(jiàn)圖10。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果有機(jī)酸峰面積及其通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的對(duì)應(yīng)濃度數(shù)據(jù)分析見(jiàn)表7。

圖10 穩(wěn)定性試驗(yàn)有機(jī)酸分離效果圖Fig.10 Separation effect diagrams of organic acids in stability experiment

測(cè)定次數(shù)蘋(píng)果酸草酸琥珀酸酒石酸檸檬酸乳酸冰醋酸1194.05156.25169.5489.8543.49176.31151.662195.15155.64173.9384.2140.58184.43139.283174.41146.53161.5293.5438.95174.33148.794189.89157.35144.7996.1944.04152.46158.995184.95176.97175.2185.3853.67182.35155.48均值187.69158.55165.0089.8344.15173.98150.84標(biāo)準(zhǔn)差8.4411.1712.505.145.7212.737.52RSD(%)0.040.070.070.050.130.070.05

(b)有機(jī)酸含量(mg/mL)

由表7可知，各有機(jī)酸峰面積的RSD為0.04%～0.13%，有機(jī)酸含量的RSD 為0.01%～0.35%，表明該方法的穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)語(yǔ)

本研究對(duì)反相C18色譜柱的色譜條件和預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化，并采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了7種有機(jī)酸。樣品經(jīng) SPE固相萃取柱純化后，采用 C18色譜柱進(jìn)行分離，流動(dòng)相為0.02 mol/L H3PO4(pH 2.7)，流速為0.6 mL/min，在紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm時(shí)，可實(shí)現(xiàn)7種有機(jī)酸的分離和精確定量。該方法的回收率為83%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<0.04%，各有機(jī)酸的線性相關(guān)系數(shù)R2>0.994，該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可用于發(fā)酵液中有機(jī)酸的定量分析。與董霞[24]測(cè)定了6種有機(jī)酸的研究結(jié)果對(duì)比，該方法能較好地證明其研究結(jié)果，發(fā)酵液中的主要有機(jī)酸的種類(lèi)在此實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證，且初步得出該發(fā)酵液中琥珀酸含量略高于其他有機(jī)酸，其可能是影響發(fā)酵液酸感的重要有機(jī)酸。但這只是研究發(fā)酵液有機(jī)酸的一個(gè)開(kāi)端，發(fā)酵液中的有機(jī)酸種類(lèi)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止已檢測(cè)的7種，影響其產(chǎn)酸的因素眾多，其有機(jī)酸含量和酸感的關(guān)系均需要我們后續(xù)跟進(jìn)研究。