孟建宇，徐慧欣

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用與環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室, 呼和浩特 010011)

酸菜是大眾化蔬菜腌漬品，在我國(guó)歷史悠久，是東北、內(nèi)蒙古等地區(qū)的主要副食品之一，深受消費(fèi)者的喜愛。研究酸菜發(fā)酵微生物對(duì)于酸菜品質(zhì)的提升具有一定的現(xiàn)實(shí)意義[1]。乳酸菌是指一類能將可發(fā)酵性碳水化合物降解，產(chǎn)生大量乳酸的非病原性的革蘭氏陽性球菌或桿菌的總稱,主要有乳酸球菌屬、乳酸鏈球菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和芽孢桿菌屬[2,3]。乳酸菌能使發(fā)酵酸菜產(chǎn)酸、產(chǎn)細(xì)菌素，提高食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善食品風(fēng)味，延長(zhǎng)保存時(shí)間，對(duì)人體具有多方面的保健作用[4,5]，如能調(diào)節(jié)腸道菌群，維持體內(nèi)微生態(tài)平衡，消除體內(nèi)有毒物質(zhì)的產(chǎn)生，降低膽固醇，增強(qiáng)免疫力等[6]。對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中乳酸菌多樣性的研究，對(duì)于開發(fā)和利用我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中蘊(yùn)含的微生物資源，闡明發(fā)酵蔬菜品質(zhì)的形成機(jī)理，進(jìn)而改進(jìn)發(fā)酵蔬菜的生產(chǎn)工藝有著重要的現(xiàn)實(shí)意義[7]。乳酸菌對(duì)食品工業(yè)有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并且乳酸菌及其細(xì)菌素可作為天然來源的食品添加劑[8，9]，因此，對(duì)傳統(tǒng)食品中乳酸菌資源進(jìn)行開發(fā)，篩選出生長(zhǎng)性能好、產(chǎn)酸力強(qiáng)、抗性強(qiáng)的優(yōu)良菌株，才能更好地滿足食品工業(yè)發(fā)酵過程。本試驗(yàn)利用經(jīng)典分類法和16S rDNA序列分析法，對(duì)自然發(fā)酵酸菜汁中的乳酸菌進(jìn)行分離、鑒定，為其進(jìn)一步深入研究和開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

農(nóng)家酸菜汁:采自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)家屬院自制酸菜。

1.1.2 培養(yǎng)基

乳酸菌分離培養(yǎng)基：牛肉膏1%；蛋白胨1%；酵母膏1%；葡萄糖1%；番茄汁10%； 吐溫80 0.05%；CaCO32%；溴甲酚綠0.01%；瓊脂1.5%； 蒸餾水100 mL；胡蘿卜汁10%；pH 6.5。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

JA2003型電子分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；SX-500 型全自動(dòng)高溫高壓滅菌鍋 TDMY KOGYO 公司；HWS12型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；移液器 Bay Gene Biotech公司；HZQ-C型空氣浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；GSP-9080 MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HR40-ⅡA2型生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司；T6新世紀(jì)型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Z-16PK離心機(jī) Sigma公司；2720 PCR儀 美國(guó)ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離和純化

采用10倍稀釋法將樣品懸浮液稀釋至10-7, 取每個(gè)濃度的稀釋液100 μL均勻涂布于固體培養(yǎng)基平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)。觀察平板中菌落生長(zhǎng)情況，挑選特征菌落進(jìn)行分離純化，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)特征觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)[10]。

1.2.2 菌株的16S rDNA序列分析

DNA的提取參考文獻(xiàn)[11]的方法。選用細(xì)菌通用引物對(duì)27F(5′-TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA-3′)和1492R(5′-AGTAAGGAGGTGATCCAACCGCA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物采用SYBR Green Ⅰ作為標(biāo)記，在1%(W/V)瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳測(cè)定。以Marker DL2000作為對(duì)照，在紫外燈下觀察DNA譜帶，照相。使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京中科瑞泰有限公司)進(jìn)行純化。用質(zhì)粒連接試劑盒(pMD19-T vector，大連寶生物工程有限公司)進(jìn)行目的片段的連接。用M13(M13+5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′、M13-5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒檢測(cè)，將陽性克隆擴(kuò)培后由中可瑞泰公司測(cè)序。獲得的核酸序列用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行Blast相似性比較，并下載最相似序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的形態(tài)和生理生化試驗(yàn)

從農(nóng)家自然發(fā)酵的酸菜汁中分離到3株乳酸菌菌株，菌落形態(tài)見表1，部分生理生化試驗(yàn)見表2。3株乳酸菌均為G+菌，菌落邊緣整齊，表面濕潤(rùn)，不透明，產(chǎn)色素。生理生化試驗(yàn)顯示：過氧化氫酶試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)均為陰性，可以利用葡萄糖和半乳糖，在15 ℃、pH 4.5條件下生長(zhǎng)。菌落形態(tài)和生理生化試驗(yàn)顯示符合乳桿菌屬特征。

表1 乳酸菌菌落特征Table 1 Colony characteristics of lactic acid bacteria

表2 乳酸菌的生理生化試驗(yàn)Table 2 Physiological and biochemical experiments of lactic acid bacteria

2.2 菌株的16S rDNA鑒定

提取菌株的DNA后用瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，DNA電泳結(jié)果(見圖1)顯示得到的DNA較完整，可用于后續(xù)的分析。對(duì)菌株的DNA進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物條帶位于Marker的2000～1000 bp之間，約1400 bp(見圖2)，符合預(yù)期長(zhǎng)度。產(chǎn)物純化后進(jìn)行pMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆子進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)后測(cè)序。測(cè)序得到3株乳酸菌16S rDNA部分片段，長(zhǎng)度均約為800 bp，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast程序進(jìn)行同源性分析，結(jié)果見表3。SC2-1、SC2-3、SC4-1與Lactobacillusplantarum的相似度均為100%。

圖1 純菌DNA提取的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.1 Agarose gel electrophoresis for the detection of pure bacteria DNA

圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR product electrophoretogram

菌株編號(hào)Blast最高同源菌 相似度(%) 最高同源屬名SC2-1Lactobacillus plantarum100乳桿菌屬SC2-3Lactobacillus plantarum100乳桿菌屬SC4-1Lactobacillus plantarum100乳桿菌屬

3 結(jié)論與討論

從自然發(fā)酵酸菜汁中分離到3株乳酸菌SC2-1、SC2-3和SC4-1，菌落為圓形，濕潤(rùn)，表面光滑或凸起，不透明，深綠色；過氧化氫酶試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)等均為陰性，G+，可以利用葡萄糖和半乳糖，在15 ℃、pH 4.5條件下生長(zhǎng)；對(duì)其進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)定，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast程序?qū)y(cè)序獲得的序列進(jìn)行同源性分析， 3株菌與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的相似度達(dá)100%。形態(tài)特征和生理生化試驗(yàn)及16S rDNA序列分析顯示，該3株乳酸菌均屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)。

酸菜是經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵形成的。乳酸菌及其代謝產(chǎn)物中既不具備分解纖維素的酶系統(tǒng)，也不具備水解蛋白質(zhì)的酶系。因此，既不會(huì)破壞植物細(xì)胞組織，又不會(huì)分解蛋白質(zhì)和氨基酸；既能保鮮，又可增強(qiáng)產(chǎn)品風(fēng)味[12]。酸菜中乳酸菌各項(xiàng)性能的優(yōu)劣直接關(guān)系到泡菜的質(zhì)量，所以乳酸菌對(duì)于提高酸菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極為重要。研究自然發(fā)酵酸菜微生物變化趨勢(shì)，分離自然發(fā)酵酸白菜中的優(yōu)良菌株，再利用混合發(fā)酵技術(shù)模擬自然條件接種發(fā)酵，可在提高產(chǎn)品風(fēng)味和品質(zhì)的前提下縮短發(fā)酵周期[13]。

植物乳桿菌常存在于發(fā)酵的蔬菜和果汁中，是傳統(tǒng)醬腌菜中的優(yōu)勢(shì)菌[14]。植物乳桿菌還是人體腸道常見的乳桿菌之一，對(duì)調(diào)節(jié)宿主健康具有重要的作用，是目前研究的熱點(diǎn)[15]。相關(guān)報(bào)道表明，我國(guó)一些少數(shù)民族地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品如酸馬奶、開菲爾等的乳酸菌資源開發(fā)利用較多。內(nèi)蒙古地區(qū)百姓家有制作醬腌菜的傳統(tǒng)，其中蘊(yùn)藏著豐富的乳酸菌資源還未被開發(fā)利用。因此，針對(duì)從內(nèi)蒙古地區(qū)百姓家庭自然發(fā)酵的醬腌菜中采集、分離獲取的植物乳桿菌進(jìn)行深入研究，對(duì)篩選性狀優(yōu)良的植物乳桿菌菌株，以及對(duì)植物乳桿菌的進(jìn)一步開發(fā)利用具有重要的意義。