吳燕春， 胡小勤， 周 蓓*， 吳麗麗， 王春玲

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530200；2.廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530200）

復(fù)方扶芳藤合劑又名百年樂，由紅參、黃芪、扶芳藤組成，功效益氣補(bǔ)血、健脾養(yǎng)心?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，復(fù)方扶芳藤合劑具有抗氧化、延緩衰老［1-2］、提高免疫力的作用［3］，臨床上能防治老年血管性癡呆，增強(qiáng)記憶力［4］。阿爾茨海默病最常見的臨床表現(xiàn)是記憶認(rèn)知功能障礙，其病因及機(jī)制不明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致其發(fā)生的重要因素。本實(shí)驗(yàn)考察復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)D-半乳糖、亞硝酸鈉致記憶障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，為該制劑相關(guān)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)昆明種小鼠60 只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)提供，許可證號(hào)SCXK（桂）2014-0003。

1.2 試藥 復(fù)方扶芳藤合劑（批號(hào)20150111，廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠）。腦復(fù)康（吡拉西坦片，批號(hào)20140802，華中藥業(yè)股份有限公司）。D-半乳糖（批號(hào)923C054，Solarbio）；亞硝酸鈉（天津博迪化工股份有限公司）；超氧化物歧化酶試劑盒（Mouse SOD Elisa kit，批號(hào)201608，武漢華美工程公司）；NO（批號(hào)20160725，南京建成生物工程研安所）、GSH-Px、MDA 試劑盒（批號(hào)20161206，南京建成生物工程研究所）、NOS1 抗體（批號(hào)BAO360，武漢博士德生物工程有限公司）；通用型SP 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)K173301B，北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器 Morris 水迷宮設(shè)備全套（成都泰盟軟件有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司，型號(hào)ELX800）；高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司，型號(hào)ST16）；生物顯微鏡（德國(guó)Leica 公司，型號(hào)DMI2500）。

2 方法

2.1 分組及給藥 60 只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、腦復(fù)康組（0.3 g／kg） 及復(fù)方扶芳藤合劑高、中、低劑量組（9、4.5、2.75 g／kg），每組10 只，正常對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水，其他各組小鼠腹腔注射D-半乳糖（120 mg／kg）、1%亞硝酸鈉（90 mg／kg），連續(xù)56 d。造模成功后，給藥組灌胃給予腦復(fù)康及復(fù)方扶芳藤合劑，正常對(duì)照組和模型組灌胃給予等量生理鹽水，劑量20 mL／kg，1 次／d，連續(xù)30 d。

2.2 小鼠學(xué)習(xí)記憶行為檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［3］ 報(bào)道采用MWM 測(cè)試法，次日進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)分為定位航行、空間探索2 個(gè)階段，時(shí)間為6 d。第1 天撤除平臺(tái)，讓各組小鼠在池中自由游泳2 min，第2 天進(jìn)入定位航行實(shí)驗(yàn)階段，共5 d，小鼠面向池壁，由4 個(gè)入水點(diǎn)放入次池中，測(cè)定60 s 內(nèi)成功進(jìn)駐平臺(tái)所需要的時(shí)間（即逃避潛伏期），最后1 d 進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，讓小鼠自由游泳，測(cè)其尋求次數(shù)和停留時(shí)間。

2.3 小鼠腦組織SOD、GSH-Px、NO、MDA 水平檢測(cè) 水迷宮實(shí)驗(yàn)后處死小鼠，摘眼球取血，冰上取腦，冷生理鹽水溶液沖洗殘血，拭干，精密稱取腦組織，剪碎后置于超聲波組織勻漿器中，加入9 倍量生理鹽水制成10%組織勻漿，按試劑盒說明書操作，ELISA 法檢測(cè)小鼠腦組織SOD水平，化學(xué)法測(cè)定小鼠腦組織NO、GSH-Px、MDA 水平。

2.4 小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察 4%甲醛固定小鼠另一半腦組織，石蠟包埋切片，烘干后脫蠟脫水，進(jìn)行HE 染色，光鏡下觀察小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)。

2.5 測(cè)定小鼠腦組織NOS1 酶的表達(dá) 采用免疫組化法。4%甲醛固定小鼠腦組織后，石蠟包埋切片，脫蠟脫水，枸櫞酸修復(fù)抗原，加入抗體顯色，經(jīng)過脫水、透明、封片后，于生物顯微鏡下觀察CA1 區(qū)NOS1 酶的表達(dá)，取5 個(gè)視野，通過Image-Proplus 軟件進(jìn)行分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為具有顯著性差異。

表1 復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，n＝10）

表1 復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 潛伏期／s 尋求次數(shù)／次 停留時(shí)間／s正常對(duì)照組 21.48±12.10** 15.90±3.84** 22.98±6.37**模型組 36.49±17.68 10.20±3.21 13.02±3.77腦復(fù)康組 25.68±14.19** 14.40±4.06* 19.02±4.37**復(fù)方扶芳藤合劑高劑量組 27.01±16.22* 13.90±3.18* 18.31±4.16*復(fù)方扶芳藤合劑中劑量組 28.12±15.68* 13.30±2.75* 17.22±4.56*復(fù)方扶芳藤合劑低劑量組 23.08±17.33 12.30±3.88 16.80±6.40

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 表1 顯示，與模型組比較，復(fù)方扶芳藤合劑高、中劑量組停留時(shí)間、尋求次數(shù)顯著升高（P＜0.05），逃避潛伏期顯著降低（P＜0.05）。

3.2 復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)SOD、GSH-Px、NO、MDA 水平的影響 表2 顯示，與模型組比較，復(fù)方扶芳藤合劑高、中劑量組SOD、GSH-Px 水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），NO、MDA 水平明顯降低（P＜0.01）。

3.3 復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的影響 圖1 顯示，正常對(duì)照組小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則，核圓，核大明顯；模型組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞層數(shù)減少，不規(guī)則，胞體腫脹，呈梭形或多邊形，核固縮，細(xì)胞核深染；各給藥組小鼠神經(jīng)細(xì)胞排列、形態(tài)、數(shù)目較模型組有所改善。

3.4 復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)小鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞NOS1 酶表達(dá)的影響 免疫陽(yáng)性神經(jīng)元主要分布于海馬CA1 區(qū)、大腦頂葉皮層等部位，光鏡下可見NOS1 陽(yáng)性反應(yīng)物定位于胞漿和胞核。圖2、表3 顯示，正常對(duì)照組小鼠海馬CA1 區(qū)排列規(guī)則，細(xì)胞核圓，輪廓清晰，染色細(xì)胞較少，呈淡染；模型組小鼠海馬錐體細(xì)胞細(xì)胞層數(shù)減少，排列較疏松紊亂，可見大量NOS1 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞；腦復(fù)康組及復(fù)方扶芳藤合劑高、中劑量組小鼠神經(jīng)元細(xì)胞排列相對(duì)規(guī)則，染色相對(duì)較淡，與模型組比較NOS1 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.01）。

表2 復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)SOD、GSH-Px、NO、MDA 水平的影響，n＝10）

表2 復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)SOD、GSH-Px、NO、MDA 水平的影響，n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 SOD／（pg·mL-1） GSH-Px／（U·mg prot-1） NO／（μmol·g prot-1） MDA／（nmol·g prot-1）正常對(duì)照組 533.9±83.01** 41.97±4.16** 3.16±0.65** 41.63±3.66**模型組 340.2±49.38 20.13±4.06 21.88±4.22 62.04±6.44腦復(fù)康組 496.5±62.38** 30.79±5.71** 13.57±2.06** 43.77±5.11**復(fù)方扶芳藤合劑高劑量組 461.4±87.31** 27.52±3.44** 15.63±2.76** 50.79±4.28**復(fù)方扶芳藤合劑中劑量組 414.4±39.11** 23.95±4.01* 16.73±2.58** 52.56±5.78**復(fù)方扶芳藤合劑低劑量組 396.5±89.72 23.08±3.29 18.86±2.19 55.36±4.04*

圖1 復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的影響（×200）

圖2 各組小鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞NOS1 酶表達(dá)（×100）

表3 復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)NOS1 酶表達(dá)的影響（n＝5）

表3 復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)NOS1 酶表達(dá)的影響（n＝5）

注：與模型組比較，**P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） NOS1 陽(yáng)性百分率／%正常對(duì)照組 — 4.36±1.68**模型組 — 37.86±8.19腦復(fù)康組 0.3 22.68±6.90**復(fù)方扶芳藤合劑高劑量組 9 26.84±4.85**復(fù)方扶芳藤合劑中劑量組 4.5 30.16±4.85**復(fù)方扶芳藤合劑低劑量組 2.25 33.52±7.37

4 討論

阿爾茨海默病患者臨床表現(xiàn)為智力減退、近期記憶缺失、相關(guān)行為能力障礙，故觀察相關(guān)藥物療效的重要指標(biāo)之一是對(duì)學(xué)習(xí)記憶進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)。阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制很多，氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡的重要因素，Markesbery等［5-6］提出了自由基學(xué)說，神經(jīng)組織富含不飽和脂肪酸，極容易受到氧自由基的攻擊［7-8］，自由基增多時(shí)可引起癡呆機(jī)體的組織和細(xì)胞發(fā)生退行性變化［9-10］。SOD 是體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶，它可催化O2-歧化反應(yīng)生成H2O2；GSH-Px 是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解酶，可特異催化還原型GSH 的還原反應(yīng)，使H2O2被GSH還原為H2O；MDA 作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，它既是評(píng)價(jià)衰老的重要指標(biāo)，又可反映出組織氧化程度水平；D-半乳糖是機(jī)體正常營(yíng)養(yǎng)成分，但其過多時(shí)在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生O2-和H2O2，過量的活性氧或自由基可引起神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，造成機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力下降，由此引起和促進(jìn)阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展；小鼠長(zhǎng)時(shí)期連續(xù)注射NaNO2時(shí)，可引起腦和全身組織反復(fù)缺血缺氧，在腦缺血損傷中后期，NOS 激活時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量NO，引起脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋超載，出現(xiàn)腦組織病理變化，興奮性氨基酸毒性增強(qiáng)，Tau 蛋白異常磷酸化增加，發(fā)生病樣的病理變化，神經(jīng)元凋亡和壞死［11］，從而造成小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降［12］。考慮到D-半乳糖結(jié)合NaNO2造模后，可部分模擬阿爾茨海默病氧化病變，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)NOS1 酶、NO 這2 個(gè)指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方扶芳藤合劑高、中劑量組顯示逃避潛伏期較模型組明顯縮短，尋求次數(shù)、平均停留時(shí)間較模型組明顯升高，表明該方起到了改善作用；NOS1 酶的陽(yáng)性百分率及NO、MDA 水平明顯降低，SOD、GSH-Px 水平明顯升高，其作用機(jī)制一方面可能是該方對(duì)NOS1 酶起到抑制作用，減少NO 生成，升高SOD、GSH-Px 水平，增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基的能力；另一方面，能使脂質(zhì)過氧化物MDA 水平下降，保護(hù)機(jī)體減少受自由基攻擊，即可能與抑制氧化損傷機(jī)制有關(guān)。因此，復(fù)方扶芳藤合劑有望成為治療阿爾茨海默病的候選藥物，但仍需進(jìn)行基礎(chǔ)研究與臨床試驗(yàn)以深入驗(yàn)證。