柴 爽， 黃佳純， 王吉利， 黃宏興， 萬 雷， 劉少津， 盧 義

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院，廣東 廣州510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心中醫(yī)骨傷科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510006）

絕經(jīng)后，女性由于卵巢功能衰退，體內(nèi)雌激素水平下降，骨骼效應(yīng)消除后促進(jìn)了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生［1］，此時患者骨量減少，骨脆性增加，輕微外力即可引發(fā)骨折，嚴(yán)重影響了生活質(zhì)量。前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎健脾活血方可明顯緩解老年骨質(zhì)疏松癥女性患者的疼痛癥狀［2］，降低骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折術(shù)后椎體再骨折的風(fēng)險［3］，其含藥血清還可通過調(diào)控wnt／β-catenin 信號通路抑制因子DKK1 影響成骨細(xì)胞的代謝［4］。本實(shí)驗(yàn)采用去卵巢大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型，探討補(bǔ)腎健脾活血方對骨密度、生物力學(xué)性能的改善作用，以及對wnt／β-catenin 信號通路的影響。

1 材料

1.1 動物 雌性SD 大鼠72 只，6 月齡，SPF 級，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號SCXK （粵）2013-0034。實(shí)驗(yàn)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF 級實(shí)驗(yàn)室（溫度21～25 ℃，相對濕度50%～70%，12 h 交替光照） 進(jìn)行，喂飼大鼠專用飼料（廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心）。

1.2 試藥 補(bǔ)腎健脾活血方為廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院院內(nèi)制劑（批件號20170030），由補(bǔ)骨脂、淫羊藿、肉蓯蓉、熟地、白芍、黃芪、菟絲子、丹參、當(dāng)歸、大棗10 味中藥組成，生藥量1.43 g／mL。阿侖膦酸鈉維D3片（Ⅱ） （杭州默沙東制藥有限公司，生產(chǎn)批號N010878）。Trizol 購自美國Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量PCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司；全細(xì)胞裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；wnt3a、β-catenin 抗體購自北京四正柏生物科技有限公司；Tublin、GAPDH 抗體購自ABclonal 公司；山羊抗兔、山羊抗鼠二抗購自美國CST公司。

1.3 儀器 雙能X 射線骨密度儀小動物專用掃描和分析軟件（美國Hologic 公司）；MTS-858miniBionix 生物材料力學(xué)試驗(yàn)機(jī)（美國MTS 公司）；T100 梯度PCR 儀；CFX96 實(shí)時熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 72 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組（24 只） 和手術(shù)組（48 只），采用背側(cè)入路雙側(cè)卵巢切除法造模，假手術(shù)組切除雙側(cè)卵巢旁脂肪組織（體積約等于卵巢），術(shù)后1 周每天肌肉注射青霉素8萬單位以預(yù)防切口感染。術(shù)后3 個月，2 組各隨機(jī)選取12只大鼠檢測腰椎骨密度以驗(yàn)證造模成功，手術(shù)組剩余的36只隨機(jī)分為模型組、補(bǔ)腎健脾活血方組、阿侖膦酸鈉維D3片（Ⅱ） 組，每組12 只。藥物用量參考第3 版《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》 中的等效劑量換算方法，大鼠用藥量＝人用劑量／60×6.3，補(bǔ)腎健脾活血方、阿侖膦酸鈉維D3片（Ⅱ）（于研缽內(nèi)研磨， 生理鹽水溶解） 日臨床劑量分別為20 mL、10 mg，分別按2.979 g／kg、1.02 mg／kg 劑量灌胃給藥，而假手術(shù)組、模型組灌胃給予等體積生理鹽水，各組每天1 次，連續(xù)3 個月。

2.2 骨密度檢測 大鼠麻醉生效后取俯臥位，采用雙能X射線掃描鼠全身，設(shè)定腰椎為感興趣區(qū)，通過儀器自帶軟件進(jìn)行腰椎骨密度分析。

2.3 標(biāo)本采集 末次給藥后大鼠禁食，次日腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL／100 g 體質(zhì)量） 麻醉，檢測骨密度。然后，處死各組大鼠，迅速分離腰4（L4） 椎體，生理鹽水濕紗布包裹，-20 ℃下保存?zhèn)溆?，迅速分離右側(cè)脛骨，剔除周圍附著軟組織，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 骨生物力學(xué)檢測 檢測前12 h，于-20 ℃冰箱中取出L4 椎體，去除椎間盤、附件、終板，砂紙打磨上下兩端以保證兩面水平，室溫下解凍后MTS 法進(jìn)行腰椎壓縮實(shí)驗(yàn)，根據(jù)儀器自帶軟件導(dǎo)出的數(shù)據(jù)分析腰椎最大載荷和剛度。

2.5 wnt2、 wnt3a、 lrp5、 lrp6、 β-catenin、 OPN、 Runx2、osterix mRNA 表達(dá)檢測 采用實(shí)時熒光定量PCR 法。取大鼠脛骨近端骨組織約30 mg，液氮研磨后Trizol 法提取總RNA，Thermo 全長酶標(biāo)儀測定其濃度和純度，取500 ng 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系為2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ7.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，dH2O 補(bǔ)平體積15 μL；反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，42 個循環(huán)；熔解曲線分析，95 ℃10 s，65 ℃5 s，每個樣品設(shè)置3 個復(fù)孔，待測基因的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.6 wnt3a、β-catenin 蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。取大鼠脛骨近端骨組織約150 mg，液氮研磨后加入全細(xì)胞裂解液200 μL，渦旋混勻，冰上裂解30 min（間斷渦旋3～5 次），4 ℃、15 000 r／min 離心15 min 后取上清提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，取50 μg，加入適量5×loading buffer 混勻，進(jìn)行10% （wnt3a）、8% （β-catenin）的SDS-PAGE 電泳，蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST 洗膜3 次，加入wnt3a、β-catenin、Tublin、GAPDH（1 ∶1 000 稀釋） 一抗，4 ℃下孵育過夜，TBST 洗膜3 次，加入山羊抗兔（wnt3a、β-catenin、GAPDH）、山羊抗鼠（Tublin） 二抗，室溫下孵育1 h，TBST 洗膜3 次，ECL 法顯影，圖像處理軟件分析各條帶的灰度值。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，計量資料采用表示，組間比較采用單因素方差分析或t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠骨密度 表2 顯示，去卵巢3 個月后與假手術(shù)組比較，手術(shù)組大鼠骨密度顯著降低（P＜0.05），表明造模成功。

表2 各組大鼠骨密度比較

表2 各組大鼠骨密度比較

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05

組別 動物數(shù)／只 骨密度／（g·cm-2）假手術(shù)組 12 0.251 8±0.011 7手術(shù)組 12 0.205 4±0.022 3*

3.2 補(bǔ)腎健脾活血方對大鼠骨密度和生物力學(xué)的影響 表

3 顯示，藥物干預(yù)3 個月后與假手術(shù)組比較，模型組骨密度、剛度、最大載荷顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎健脾活血方組三者顯著升高（P＜0.05）。

3.3 補(bǔ)腎健脾活血方對wnt／β-catenin 信號通路基因的影響 表4 顯示，與假手術(shù)組比較，模型組wnt2、lrp6 mRNA表達(dá) 差 異 無 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義 （P ＞0.05）， wnt3a、 lrp5、 βcatenin、Runx2、osterix mRNA 表達(dá)顯著降低 （P ＜0.05），OPN 基因表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎健脾活血方組能顯著提高前五者mRNA 表達(dá)（P＜0.05），顯著降低后者mRNA 表達(dá)（P＜0.05）。

3.4 補(bǔ)腎健脾活血方對wnt3a、β-catenin 蛋白的影響 表5、圖1 顯示，與假手術(shù)組比較，模型組wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎健脾活血方組能顯著提高兩者蛋白表達(dá)（P＜0.05）。

表3 補(bǔ)腎健脾活血方對大鼠骨密度和生物力學(xué)的影響

表3 補(bǔ)腎健脾活血方對大鼠骨密度和生物力學(xué)的影響

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 動物數(shù)／只 骨密度／（g·cm-2） 剛度／（N·mm-1） 最大載荷／N假手術(shù)組 9 0.237 6±0.016 6 397.13±77.32 147.78±20.90模型組 11 0.184 4±0.007 8* 248.81±27.82* 105.74±3.93*補(bǔ)腎健脾活血方組 10 0.194 7±0.007 6＃ 362.31±31.71＃ 182.23±41.58＃阿侖膦酸鈉維D3 片（Ⅱ）組 12 0.216 6±0.023 4＃ 402.43±68.38＃ 192.18±12.62＃

4 討論

中醫(yī)把骨質(zhì)疏松歸于“骨痿” 范疇，認(rèn)為腎虛是疾病發(fā)生的根本，而脾虛是促進(jìn)因素，血瘀是病理機(jī)制［5］，臨床治療以補(bǔ)腎壯骨、健脾活血之法立方，大多以補(bǔ)腎健脾活血方為基礎(chǔ)方加減使用，屢獲良效［2-3，6］。補(bǔ)腎健脾活血方是廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院協(xié)定方，是右歸飲（ 《景岳全書》 ） 合蓯蓉湯（ 《圣濟(jì)總錄》 ） 加減化裁而來，由補(bǔ)骨脂、淫羊藿、肉蓯蓉、熟地、白芍、黃芪、菟絲子、丹參、當(dāng)歸、大棗10 味藥材組成，方中補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎壯陽強(qiáng)骨，為君藥，臣以淫羊藿、肉蓯蓉、菟絲子增強(qiáng)其補(bǔ)腎助陽之效，佐以熟地、白芍滋陰 “陰中求陽”，使“陽得陰助而生化無窮”，黃芪補(bǔ)氣健脾，丹參、當(dāng)歸補(bǔ)血活血通絡(luò)，大棗和中，其中黃芪合當(dāng)歸補(bǔ)氣生血，合大棗補(bǔ)中益氣，合丹參理氣活血，使全方補(bǔ)而不滯，滋而不膩，助陽而不傷陰，共奏補(bǔ)腎壯骨、健脾益氣、活血通絡(luò)之功效。本實(shí)驗(yàn)采用摘除雙側(cè)卵巢的方法建立大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型，并在造模3 個月后進(jìn)行骨密度測定，確認(rèn)造模成功，并證實(shí)補(bǔ)腎健脾活血方能有效提高腰椎骨密度，改善腰椎生物力學(xué)性能，提高腰椎剛度和最大載荷。

表4 補(bǔ)腎健脾活血方對wnt／β-catenin 信號通路基因的影響

表4 補(bǔ)腎健脾活血方對wnt／β-catenin 信號通路基因的影響

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 動物數(shù)／只 Wnt2 Wnt3a Lrp5 Lrp6 β-catenin OPN Runx2 osterix假手術(shù)組 9 1.06±0.48 1.09±0.51 1.17±0.18 1.12±0.71 1.07±0.23 1.01±0.15 1.01±0.12 1.09±0.21模型組 11 1.35±0.50 0.64±0.17*0.70±0.18*0.84±0.20 0.59±0.11*2.56±0.91*0.28±0.03*0.49±0.08*補(bǔ)腎健脾活血方組 10 2.58±0.85 1.49±0.22＃2.97±1.28＃0.66±0.01 1.42±0.15＃1.15±0.33＃1.76±0.59＃ 1.76±0.47＃阿侖膦酸鈉維D3 片（Ⅱ）組 12 2.72±1.13 1.28±0.68 1.09±0.26 1.94±1.83 1.06±0.73 0.84±0.56＃2.03±0.31＃ 1.21±0.46

表5 補(bǔ)腎健脾活血方對wnt3a、β-catenin 蛋白表達(dá)的影響

表5 補(bǔ)腎健脾活血方對wnt3a、β-catenin 蛋白表達(dá)的影響

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 動物數(shù)／只Wnt3a／GAPDH β-catenin／Tublin假手術(shù)組 9 3.20±0.74 2.13±0.19模型組 11 1.39±0.14* 1.68±0.16*補(bǔ)腎健脾活血方組 10 2.98±0.85＃ 2.90±0.25＃阿侖膦酸鈉維D3 片（Ⅱ）組 12 1.50±0.21 2.29±0.38

圖1 各組wnt3a、β-catenin 蛋白表達(dá)

Wnt／β-catenin 屬于經(jīng)典wnt 信號通路［7］，在骨形成過程中起到重要作用［8］。Wnt 家族蛋白是一類分泌型糖蛋白，可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化［9-10］，它與細(xì)胞膜表面的Frizzled 受體及其共同受體lrp5／6 結(jié)合，激活細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蓬亂蛋白（Dishevelled，Dvl），能使GSK-3β 磷酸化活性降低，阻止βcatenin 降解，使其穩(wěn)定在細(xì)胞質(zhì)中并富集，穩(wěn)定的βcatenin 轉(zhuǎn)運(yùn)入核，與TCF-4／LEF 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，上調(diào)下游靶基因Runx2、osterix 等表達(dá)［11-12］。造模后3 個月，模型組lrp5、β-catenin 基因的轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化，但β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低［13］；造模后4 個月，模型組β-catenin 基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)均明顯降低［14］；造模后6 個月，模型組wnt2、lrp6 基因表達(dá)無明顯變化，而wnt3a、lrp5、βcatenin、Runx2、osterix 基因表達(dá)明顯降低，表明Wnt／βcatenin 信號通路處于抑制狀態(tài)。補(bǔ)腎健脾活血方干預(yù)后，可激活Wnt／β-catenin 信號通路，促進(jìn)wnt3a、lrp5、β-catenin、Runx2、osterix 基因轉(zhuǎn)錄，提高wnt3a、β-catenin 蛋白表達(dá)，表明該方可通過調(diào)控Wnt／lrp5／β-catenin 來促進(jìn)骨形成。另外，阿侖膦酸鈉維D3 片（Ⅱ） 是治療骨質(zhì)疏松癥一線藥物的含氮雙膦酸鹽，主要作用機(jī)制是抑制骨吸收［15］，同時對成骨細(xì)胞分化和礦化也起到一定作用［16］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它雖然對Wnt／β-catenin 信號通路無明顯調(diào)控作用，但能明顯提高成骨分化因子Runx2 表達(dá)，osterix 表達(dá)也亦有升高趨勢，與前期報道結(jié)果一致［16］。

骨橋蛋白（OPN） 可由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞分泌，介導(dǎo)破骨細(xì)胞的活化和與骨基質(zhì)的黏附［17］，在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者中其血清水平增高，與腰椎骨量丟失呈負(fù)相關(guān)［18-19］；在去卵巢大鼠中，造模后4、8、12 周其腰椎基因和蛋白表達(dá)均明顯升高［20］；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，去卵巢大鼠造模后6 個月脛骨近端其基因表達(dá)明顯升高，而補(bǔ)腎健脾活血方干預(yù)后明顯降低，表明它可通過下調(diào)表達(dá)來抑制破骨細(xì)胞活化。

綜上所述，補(bǔ)腎健脾活血方可提高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠的腰椎骨密度和生物力學(xué)性能，其機(jī)制可能與調(diào)控wnt／lrp5／β-catenin 信號通路和OPN 表達(dá)有關(guān)。