杜銀香， 張建偉， 胡澤華， 涂 星

（湖北民族大學醫(yī)學部，湖北 恩施445000）

華中枸骨Ilex centrochinensis S.Y.Hu 又稱針齒冬青，是冬青科冬青屬植物，主要生長在海拔300～1 000 m 的山坡和灌木叢中，廣泛分布于湖北恩施，其性味甘涼，具有清熱解毒功效，藥用部位主要為根和葉，其中后者在民間常被用來治療燙火傷［1］，在其他地區(qū)也是制作苦丁茶的原料［2-4］。目前發(fā)現(xiàn)，華中枸骨葉中主要含有萜類、有機酸、黃酮類等成分［5-7］，其中黃酮類具有廣泛生物活性，如抗氧化、抗癌、抗菌［8-11］等，但目前對該類成分的研究較少，并且尚未涉及其提取工藝和抑菌作用。因此，本實驗在單因素試驗基礎上采用Box-Behnken 響應面法優(yōu)化華中枸骨葉總黃酮超聲提取工藝，同時考察其抑菌作用，以期為該藥材相關研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥 華中枸骨葉采自湖北省恩施市建始縣，經(jīng)湖北民族大學醫(yī)學部胡澤華博士鑒定為冬青科冬青屬植物華中枸骨Ilex centrochinensis S.Y.Hu 的葉，烘干后粉粹，過60目篩。蘆丁對照品（上海金穗生物科技有限公司）。MH 瓊脂、MH 肉湯（杭州微生物試劑有限公司）；金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、宋內(nèi)志賀菌為湖北民族大學醫(yī)學部微生物實驗室保存菌種。亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 SSW 微電腦電熱恒溫水槽（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；NU-425-400S 生物安全柜 （美國NuAire 公司）；DFY-1000C 高速萬能粉粹機（無錫沃信儀器有限公司）；CL-32 L 高壓蒸汽滅菌器（日本ALP 公司）；THC-10B 數(shù)控超聲波提取機（濟寧天華超聲電子儀器有限公司）；ELJ-2800R 紫外可見分光光度計（上海昂拉儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含有量測定

2.1.1 供試品溶液制備 稱取藥材粉末適量，25 ℃下按液料比10 ∶1 加入60%乙醇，置于超聲波提取機（功率480 W） 中提取10 min，提取液過濾，濾渣在相同條件下再提取1 次，合并2 次濾液，離心、濃縮，加水定容，即得。

2.1.2 線性關系考察［12］配制0.1 mg／mL 蘆丁對照品溶液，分別取0、1、2、3、4、5 mL 于10 mL 量瓶中，加30%乙醇至5 mL，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入1 moL／L 氫氧化鈉4 mL，加水定容至10 mL，搖勻，放置15 min，于510 nm 波長處測定吸光度。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A） 進行回歸，得到方程為A ＝10.17X ＋0.015 3 （R ＝0.999 7）， 在 0.010 ～0.050 mg／mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.3 精密度試驗 取對照品溶液，按“2.1.2” 項下方法測定6 次，測得吸光度RSD 為0.19%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，按“2.1.2” 項下方法顯色后于0、15、30、45、60、75 min 測定，測得吸光度RSD 為1.22%，表明溶液在75 min 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 重復性試驗 精密稱取藥材粉末6 份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2” 項下方法測定，測得吸光度RSD 為1.11%，表明該方法重復性好。

2.1.6 加樣回收率試驗 精密量取總黃酮含有量已知的供試品溶液6 份，加入對照品溶液，按“2.1.2” 項下方法測定，測得蘆丁平均加樣回收率為99.78%，RSD 為1.35%。

2.1.7 測定方法 精密吸取總黃酮提取液適量， 按“2.1.2” 項下方法顯色測定，平行3 次，取平均值，計算含有量，公式為含有量＝CNV／M（C 為提取液質(zhì)量濃度，N為稀釋倍數(shù)，V 為提取液定容體積，M 為藥材粉末質(zhì)量）。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數(shù) 固定提取時間10 min，液料比10 ∶1，加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇，測定總黃酮含有量，結(jié)果見圖1。由圖可知，乙醇體積分數(shù)在40%～60%范圍內(nèi)總黃酮含有量逐漸提高，60%時最高，但進一步增加后反而下降，這是因為乙醇體積分數(shù)升高，其極性也會隨之改變，根據(jù)相似相溶原理，從藥材中溶出的總黃酮量也會有所變化，同時醇溶性雜質(zhì)溶出量也會增加，會與總黃酮競爭性地與乙醇-水分子結(jié)合，導致后者溶解度降低，含有量下降［13］。因此，確定最佳乙醇體積分數(shù)為60%。

圖1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮含有量的影響

2.2.2 液料比 固定乙醇體積分數(shù)60%， 提取時間10 min，選擇液料比5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1，測定總黃酮含有量，結(jié)果見圖2。由圖可知，當液料比小于20 ∶1 時，隨著乙醇用量增加總黃酮含有量逐漸升高，在20 ∶1 時最高，但隨著乙醇用量進一步增加變化不明顯，可能是一開始植物細胞內(nèi)外總黃酮質(zhì)量濃度差變大，有利于其溶出［14］，但當液料比為20 ∶1 時植物細胞中該成分已經(jīng)被較完全地提取出來，故再增加乙醇用量其含有量也無明顯提高［15］，而且會提高生產(chǎn)成本。因此，確定最佳液料比為20 ∶1。

2.2.3 提取時間 固定乙醇體積分數(shù)60%，液料比20 ∶1，提取10、20、30、40、50 min，測定總黃酮含有量，結(jié)果見圖3。由圖可知，隨著提取時間延長，總黃酮含有量先升后降，在20 min 時最高，但隨著其進一步延長反而下降，可能與提取時間過長破壞了黃酮中某些結(jié)構(gòu)有關［16］。

圖2 液料比對總黃酮含有量的影響

因此，確定最佳提取時間為20 min。

圖3 提取時間對總黃酮含有量的影響

2.3 Box-Behnken 響應面法 在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數(shù)（A）、液料比（B）、提取時間（C） 為影響因素，總黃酮含有量為（Y） 評價指標，設計3 因素3 水平試驗。因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平

表2 試驗設計及結(jié)果

通過Design-Expert 8.0.6.1 軟件對表2 數(shù)據(jù)進行分析，得到 方程為Y ＝50.68-2.36A ＋3.46B ＋2.52C-1.16AB-0.25AC＋1.21BC-2.85A2-0.12B2-1.13C2，方差分析見表3。由表可知，模型P ＜0.000 1，極顯著，而失擬項P ＞0.05，不顯著，表明模型擬合度良好；決定系數(shù)R2＝0.992 4，校正后表明模型能解釋98.27%的響應值變化；總變異系數(shù)CV ＝1.06%，表明試驗可信度和精確度高［17］；A、B、C、AB、BC、A2、C2差異顯著（P＜0.05），其他項不顯著（P＞0.05），各因素影響程度依次為B＞C＞A。

表3 方差分析

響應面分析［18-19］見圖4，可知乙醇體積分數(shù)和液料比、液料比和提取時間之間交互作用有明顯影響。

2.4 驗證試驗 利用Design-Expert 8.0.6.1 軟件的優(yōu)化功能，得到最優(yōu)工藝為乙醇體積分數(shù)為53.40%，液料比25 ∶1，提取時間30 min，總黃酮含有量為57.86 mg／g，為了操作方便，將乙醇體積分數(shù)調(diào)整為55%，其他條件不變。然后，進行3 批驗證試驗， 測得平均總黃酮含有量為57.81 mg／g，與預測值57.86 mg／g 接近，表明模型擬合度良好。

圖4 各因素響應面圖

2.5 抑菌試驗 采用牛津杯法［20］。取0.1 mL 菌液（1×107cfu／mL） 均勻涂布在90 mm MH 瓊脂培養(yǎng)基上后，將5個牛津杯均勻放置在涂菌后的平板上，各加入藥液200 μL，以無菌水為陰性對照，慶大霉素為陽性對照。將平板放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h 后觀察，重復3 次，取平均值，結(jié)果見表4、圖5。由此可知，優(yōu)化工藝下得到的總黃酮提取液對常見細菌均有抑制作用，而且隨著總黃酮質(zhì)量濃度的提高抑菌圈直徑逐漸增大。

表4 總黃酮提取液對細菌的抑制作用（mm，n＝3）

表4 總黃酮提取液對細菌的抑制作用（mm，n＝3）

供試菌種 50總黃酮／（2 m 5 g· mL-1）12.5陽性對照 陰性對照金黃色葡萄球菌 21.50±0.50 20.00±0.50 18.50±0.66 28.73±0.21 —大腸埃希菌 14.58±0.95 13.00±0.50 11.25±0.25 28.33±0.24 —銅綠假單胞菌 12.33±0.29 11.50±0.50 11.00±0.50 28.83±0.62 —宋內(nèi)志賀菌 10.00±0.00 — — 24.50±0.41 —

圖5 總黃酮提取液對細菌的抑制作用

3 討論

在優(yōu)化工藝（提取溫度25 ℃，超聲功率480 W，乙醇體積分數(shù)55%，液料比25 ∶1，提取時間30 min，提取次數(shù)2 次） 下，華中枸骨葉總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、宋內(nèi)志賀菌有一定抑制作用，并呈濃度依賴性。近年來隨著抗生素大量不合理使用，耐藥菌株越來越多，但細菌對有抗菌作用中草藥產(chǎn)生耐藥性的速度慢于對抗生素的，而且容易消失［21］，故本實驗也可為臨床上防止菌株產(chǎn)生耐藥性提供新思路。