趙新望， 徐文華， 趙 陽， 伍燕宏， 羅 蔚， 朱梓銘， 鄭景輝

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧530001）

我國心血管疾病發(fā)生率不斷升高， 《中國心血管病報告2017》 推算目前患病人數(shù)為2.9 億，其中冠心病1 100 萬［1］，2013 年死亡人數(shù)較1990 年增加了90.9%［2］。冠心病屬于中醫(yī)“胸痹”“真心痛” “厥心痛”范疇，中藥在相關(guān)治療方面有其獨到之處，其中川芎有活血行氣、祛風(fēng)止痛功效，其所含成分川芎嗪的作用已得到廣泛的認可，但研究發(fā)現(xiàn)該藥材主要化合物為苯酞類和酚酸類，前者含有量更高，而后者很低很少，甚至在許多樣品中無法被檢測出來，故川芎嗪無法作為川芎質(zhì)量評價的指標［3］。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出川芎主要化合物成分及其發(fā)揮作用的相關(guān)靶點，挖掘冠心病已知相關(guān)靶點，通過生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID）對靶點基因本體（GO）生物過程，以及京都基因與基因組百科全書（KEGG）中代謝通路進行分析，為該藥材治療冠心病的進一步探索提供參考。

1 材料

TCMSP（中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺，http： ／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）； Pharm-Mapper （反 向 藥 效 團 匹 配 數(shù) 據(jù) 庫， http： ／／59.78.98.102／pharmmapper／submit_ file.php）；String（蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，https： ／／string-db.org／cgi／network.pl ）； GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫（https： ／／www.genecards.org／）； Venny2.1.0（http： ／／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／）；Cytoscape3.2.1 軟件 （http： ／／cytoscapeweb.cytoscape.org／）；DAVID（基因注釋數(shù)據(jù)庫，http： ／／david.nifcrf.gov／）； GraphPad Prism 7.00 軟 件（https： ／／www.graphpad.com／）。

2 方法

2.1 川芎中化合物及作用靶點的篩選 依托TCMSP 檢索出與川芎相關(guān)的所有化合物成分，基于樣本量、數(shù)據(jù)的復(fù)雜性及文獻報道，根據(jù)藥代動力學(xué)（ADME） 參數(shù)確定藥物口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18 作為篩選條件，將篩選后得到的化合物成分上傳到PharmMapper 服務(wù)器，得到其作用靶點。最后，應(yīng)用String 數(shù)據(jù)庫通過輸入靶點名稱并限定物種為人，將檢索得到的所有靶點校正為其官方名稱（official symbol） 后，獲取與化合物成分相關(guān)的靶點。

2.2 冠心病潛在作用靶點的篩選 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索與冠心病發(fā)病相關(guān)的靶點，它可通過Gifts 算法來計算靶點與疾病之間的相關(guān)度，并以其進行排序，選擇相應(yīng)靶點。

2.3 靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析 通過venny2.1.0 軟件將川芎成分靶點與冠心病疾病靶點取交集，得到川芎治療冠心病的潛在作用靶點。然后，由String 數(shù)據(jù)庫得到靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

2.4 作用靶點富集分析網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 應(yīng)用David數(shù)據(jù)庫對川芎作用靶點的生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞成分（CC）進行KEGG 通路富集分析，采用Omicshare 軟件繪制KEGG 通路富集分析氣泡圖，以進一步揭示川芎治療冠心病的作用機制。

2.5 化合物-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將川芎化合物和作用靶點導(dǎo)入Cytoscape 軟件，構(gòu)建川芎化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測出川芎治療冠心病發(fā)揮主要作用的靶點與化合物。

3 結(jié)果

3.1 化合物及其作用靶點 檢索得到川芎化合物有189 個，符合篩選條件的7 個，分別為扁桃醇、楊梅酮、含川哚、洋川芎醌、川芎萘呋內(nèi)酯、谷甾醇、FA，見表1。然后，將PharmMapper 數(shù)據(jù)庫中所有靶點刪除重復(fù)的，整合得到川芎作用靶點481個；經(jīng)GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索，整合得到冠心病靶點5 264 個，取相關(guān)度大于20 的443 個，通過venny2.1.0 軟件取兩者交集，韋恩圖見圖1；川芎、冠心病作用靶點取交集，得到潛在作用靶點31 個，見表2。

表1 川芎關(guān)鍵化合物Tab.1 Key compounds in Chuanxiong Rhizoma

圖1 韋恩圖Fig.1 Venn diagram

表2 川芎治療冠心病的關(guān)鍵靶點Tab.2 Key targets for Chuanxiong Rhizoma in treating coronary heart disease

3.2 靶點相互作用網(wǎng)絡(luò) 由String 數(shù)據(jù)庫得到靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），其中“邊” 代表作用靶點之間的關(guān)聯(lián)，其粗細用combine score 表示，“邊” 越粗，combine score 值越大，代表其結(jié)合度越大；節(jié)點代表作用靶點。由圖可知，共有31 個節(jié)點、93 條邊，平均節(jié)點度為6，平均局部聚類系數(shù)為0.605。

圖2 川芎靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Protein interaction network of Chuanxiong Rhizoma tragets

3.3 化合物-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖 通過Cytoscape

3.5.1 軟件構(gòu)建川芎治療冠心病化合物-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），體現(xiàn)了川芎治療冠心病多成分、多靶點協(xié)同作用的特點。

圖3 化合物-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Compounds-targets interaction network

3.4 靶點的GO 富集分析 利用David 數(shù)據(jù)庫，從生物過程、分子功能、細胞成分3 個水平對31 個關(guān)鍵靶點進行分類分析，分別得到70、16、15 條，P＜0.05 者分別為56、9、9 條。然后，通過Graph-Pad Prism 7 軟件將這些條目做成可視化條形圖（生物過程條目較多，取排名前10 的條目），見圖4。

圖4 GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

3.5 KEGG 通路富集分析 對川芎作用于冠心病主要的31 個靶點進行KEGG 通路富集分析，得到6 條P＜0.05 者，再通過Omicshare 軟件對其進行可視化分析，氣泡圖見圖5。

4 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可從分子水平上預(yù)測藥物治療疾病的靶點、通路等，近年來得到了越來越廣泛地認可和應(yīng)用，故本研究通過該方法研究川芎治療冠心病的作用機制，結(jié)果得到7 個主要化合物，31 個作用于冠心病的主要靶點，主要涉及凝血、血管生成、血管擴張、炎癥反應(yīng)、抗氧化、血壓調(diào)節(jié)6 個生理病理過程。血管性血友病因子（VWF） 及凝血因子（F2、F5、F11、F13A1） 主要與凝血過程有關(guān)，VWF 與血小板結(jié)合后可導(dǎo)致動脈粥樣斑塊形成，而VWF 缺陷的小鼠中動脈粥樣斑塊較少［4］；F2 激活是凝血過程的第一步，故抗凝治療為冠心病重要治療方案； 血管表皮生長因子（EGF） 介導(dǎo)的信號級聯(lián)在血管新生過程中發(fā)揮重要作用，是最重要的促血管形成和分化調(diào)節(jié)因子之一，細胞在缺氧時其合成量會升高12 倍，可明顯促進全身多處組織器官的血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、趨化［5-6］；肌細胞特異性增強因子2A（MEF2A） 在動脈粥樣硬化小鼠主動脈內(nèi)皮細胞中表達降低，該基因沉默可明顯上調(diào)小鼠主動脈內(nèi)皮細胞間黏附分子-1、血管細胞黏附分子-1、纖溶酶原激活物抑制劑-1 表達［7］。

圖5 KEGG 通路富集分析高級氣泡圖Fig.5 Senior bubble chart for KEGG pathway enrichment analysis

血管擴張方面，一氧化氮合酶（NOS） 催化左旋精氨酸時可產(chǎn)生NO，具有強烈的擴血管作用，能降低平均動脈血壓，調(diào)節(jié)全身各血管靜息張力，也是心臟血流動力學(xué)調(diào)節(jié)的重要因子［8］。炎癥反應(yīng)方面，跨膜受體蛋白1（Notch1） 在巨噬細胞分化過程中可促進M1 型巨噬細胞的激活和細胞因子的釋放引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致動脈粥樣硬化，干擾Notch1 信號通路則可明顯促進抗炎癥型M2 型巨噬細胞的產(chǎn)生，上調(diào)抗炎癥細胞因子的分泌［9］；半乳凝集素（LGALS） 可結(jié)合CD98 促進巨噬細胞激活，活化的巨噬細胞分泌纖維化細胞因子，刺激肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，最終參與不良心臟重構(gòu)和心肌纖維化。MacKinnon 等［10］發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化小鼠中缺乏LGALS 的內(nèi)皮下幾乎沒有動脈斑塊形成。抗氧化方面，機體在缺血、缺氧時可產(chǎn)生大量氧自由基，肌紅蛋白（MB） 是一種含亞鐵血紅素的低分子，可運輸和儲存氧氣，不同原因引起心肌組織損傷均可導(dǎo)致血液中MB 水平增加，故它是急性心梗早期最靈敏的指標；超氧化物歧化酶（SOD） 是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶，為生物體內(nèi)清除氧自由基的首要物質(zhì)，其血清水平與血管結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，故可用于標記心血管變化；調(diào)脂方面，上調(diào)膽固醇-7α 羥化酶（CYP7A1） 和過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα） 表達可調(diào)節(jié)血脂［11］，降低血壓，以達到改善動脈粥樣硬化的目的；醛固酮是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的一部分，其激活程度與冠心病嚴重程度密切相關(guān)，川芎有效成分可能通過與醛固酮受體結(jié)合，以負反饋機制減少醛固酮的分泌，減低激活程度，降低血壓。然后，對31 個主要靶點進行GO 富集分析，得到其涉及的生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞成分（CC） 相關(guān)信息。

P＜0.05 的前20 個生物過程中與冠心病相關(guān)的有17 個，主要涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、凝血、血管生成、血管擴張、血壓調(diào)節(jié)等方面。缺氧時，機體產(chǎn)生大量的氧自由基，超氧化物歧化酶將這些氧自由基轉(zhuǎn)變?yōu)檫^氧化氫，然后由過氧化氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害的水和氧，以減輕缺氧對機體造成的損害，而且此時可激活缺氧誘導(dǎo)因子，缺氧誘導(dǎo)因子可使血管再生和修復(fù)微血管梗阻［12］；根據(jù)凝血酶原激活物形成始動途徑和參與因子的不同，可將凝血途徑分為內(nèi)源性、外源性，前者蛋白參與心血管疾病發(fā)生，導(dǎo)致血栓形成［13-17］；血小板通過脫顆粒作用釋放EGF，促進血管內(nèi)皮細胞增殖，劉一劍等［18］研究表明，其水平升高在冠心病的發(fā)生發(fā)展中可能作為一個獨立危險因子存在；MEF2A 基因沉默可明顯上調(diào)ICAM-1、VCAM-1、PAI-1 表達，其變異更容易導(dǎo)致冠心病的發(fā)生［19］；nNOS 不僅可生成NO 來擴張血管，還可生成H2O2，同樣可起到擴張血管的作用，大鼠血管內(nèi)膜被乙酰膽堿刺激后會增加nNOS 生產(chǎn)H2O2［20］；劉紅瓊等［21］報道， 脈壓、脈壓指數(shù)與高血壓患者冠心病發(fā)生有關(guān)，特別是脈壓指數(shù)越大，冠心病發(fā)生率越高，冠脈病變越嚴重，故血壓調(diào)節(jié)對冠心病治療非常重要。

P＜0.05 的分子功能有9 個，涉及抗氧化、延長作用時間、保護心肌、抗凝4 個方面。血紅素結(jié)合蛋白是一種血漿急性期糖蛋白，其功能主要是與循環(huán)中多余的游離血紅素結(jié)合，并轉(zhuǎn)移到特定的細胞處理［22］，對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕多余的游離血紅素造成的組織損傷［23］；蛋白結(jié)合是指藥物進入血液循環(huán)與血漿蛋白的結(jié)合，成為結(jié)合型藥物，暫時失去一般藥理活性，并“儲存” 在血液中，起到藥庫的作用，對于藥物作用及其維持時間長短有重要意義，一般蛋白結(jié)合率高的藥物體內(nèi)消除會比較慢，作用維持時間長，川芎化合物與血漿蛋白的結(jié)合力較強［24］；石天堯等［25］發(fā)現(xiàn)，心肌缺血／再灌注大鼠模型血清中肌酸激酶活性和丙二醛水平顯著降低，表明半乳糖苷具有明顯的心肌保護作用；一些研究表明，經(jīng)高鎂培養(yǎng)基培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞中NO 產(chǎn)生增加，可防止NF-κB 活化，降低基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9） 活性，上調(diào)VWF 蛋白水解，抑制血小板黏附［26-27］，達到抗凝效果。

P＜0.05 的細胞成分有9 種，涉及炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)3 個方面。血小板α 顆粒是血小板中可分泌蛋白質(zhì)的主要貯存部位，在冠狀動脈粥樣病變時其膜蛋白表達增高，從而介導(dǎo)炎癥細胞黏附聚集在動脈粥樣斑塊周圍，造成局部炎癥細胞的浸潤性反應(yīng)，釋放大量組織活性因子，在這些組織活性因子的共同作用下最終導(dǎo)致斑塊穩(wěn)定性下降、斑塊破裂［28］；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER） 是在真核細胞中發(fā)現(xiàn)的一種細胞器，約有30 多種膜結(jié)合蛋白，另有30 多種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，其分布具有異質(zhì)性，在冠心病患者中同型半胱氨酸誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的半胱天冬酶3 活化增強，證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)與冠心病的發(fā)生機制可能存在關(guān)聯(lián)［29］；過氧化物酶體是一種存在于幾乎所有真核細胞中的細胞器［30］，可把氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2而發(fā)揮抗氧化的作用。

對川芎作用于冠心病主要的31 個靶點進行KEGG 通路富集分析，得到P＜0.05 的通路6 條。其中，補體級聯(lián)與凝血級聯(lián)、缺氧誘導(dǎo)因子-1 信號通路、過氧化物酶體通路與冠心病相關(guān)，涉及凝血過程、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、血管擴張、心肌保護等方面；凝血因子是凝血過程的主要參與者，川芎作用于冠心病的主要靶點包括多種凝血因子，由此推測它可能通過抑制其表達來達到抗凝的目的，從而改善冠狀動脈粥樣硬化的程度；補體系統(tǒng)成分由30 多種蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段組成，主要分為固有成分 （C1qrs-C9、 B／D／P 因子、 MBL、絲氨酸蛋白酶等）、補體受體（CR1、CR2、CR3、C3a R，C5aR 等） 和調(diào)節(jié)分子（C1INH、DAF、H因子等），黃政［31］認為，后處理能夠上調(diào)HSP90表達，并減少缺血-再灌注（缺氧／復(fù)氧） 誘導(dǎo)的補體C3／C5a、NF-κB、IL-1β、TNF-α 表達及心肌細胞凋亡；早期缺氧時，缺氧誘導(dǎo)因子激活后可激活下游EGF、NOS2 基因表達，EGF 表達可促進新生毛細血管生成，NOS2 作為催化劑參與產(chǎn)生NO，進而擴張血管，調(diào)節(jié)心臟血流；研究表明［32］，缺氧時HIF-1α 表達增加能活化VEGF 基因轉(zhuǎn)錄，增強其mRNA 穩(wěn)定性，上調(diào)其mRNA 表達，從而促使血管生成，降低缺氧對組織的負面影響；缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α） 是機體細胞在低氧環(huán)境中產(chǎn)生的一種轉(zhuǎn)錄因子，參與低氧反應(yīng)基因的調(diào)控，可促進血紅素氧化酶-1 （HO-1）、 血管生長因子（VEGF） 等因子表達，其中HO-1 具有抗氧化、抗炎、擴張血管作用，被認為是血管保護因子，而且HIF 誘導(dǎo)的HO-1 對缺血-再灌注損傷具有長期的心肌保護作用［33］。

綜上所述，川芎可能主要通過抗氧化、抗炎、抗凝血、促進血管生成、擴張血管、調(diào)節(jié)血壓等方面來治療冠心病。但本研究僅對一些數(shù)據(jù)庫進行挖掘，對川芎的功效作用進行預(yù)測，今后在基礎(chǔ)研究、臨床實驗中還需要進一步驗證?；衔镆設(shè)B和DL 作為篩選條件也存在一定局限性，如川芎嗪注射液目前在臨床上已取得廣泛應(yīng)用，故不能僅依靠口服利用度來篩選化合物，該值較低者也需要加以重視。另外，本研究只對川芎進行了研究，而在臨床上它大多與其他中藥進行配伍來治療冠心病，同時各中藥之間的相互作用也未能得到體現(xiàn)，需要不斷完善。