何 勇， 吳榮艷， 劉德慧， 譚 菲*， 彭金亮， 王麗芳， 賴 珺， 張麗慧，劉宏明

（1.贛州市人民醫(yī)院，江西 贛州341000；2.贛州市第三人民醫(yī)院，江西 贛州341000）

慢性腎功能衰竭為多種慢性腎臟病緩慢惡化發(fā)展的最終結(jié)果，由于其臨床癥狀可引發(fā)多方面并發(fā)癥，而且病理基礎(chǔ)復(fù)雜， 導(dǎo)致死亡率逐年攀升［1-2］，透析清除腎內(nèi)代謝廢物和腎移植可顯著降低患者死亡率，延長(zhǎng)生命周期，但前者技術(shù)復(fù)雜，費(fèi)用高昂，并發(fā)癥多，次數(shù)過(guò)于頻繁；后者需要等待合適的腎源等［3］。核轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路能調(diào)控核內(nèi)相應(yīng)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，影響炎癥介質(zhì)合成，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎臟損害及腎纖維化，慢性腎功能衰竭大多與腎功能炎癥相關(guān)，進(jìn)一步加重衰竭進(jìn)展。

冬瓜皮具有利尿消腫的功效，用于治療水腫脹滿、小便不利、暑熱口渴、小便短赤等癥，而且制炭后還增加了吸附清除毒素的功能［4］，并產(chǎn)生部分炭素（即活性炭），但目前相關(guān)研究較少［5］。因此，本實(shí)驗(yàn)探討冬瓜皮炭對(duì)慢性腎衰竭大鼠的影響，考察其對(duì)NF-κB 信號(hào)通路激活和抑制途徑的干預(yù)作用。

1 材料

1.1 藥材 冬瓜皮購(gòu)于贛州益豐大藥房醫(yī)藥連鎖有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室吳啟南教授鑒定為葫蘆科植物冬瓜Benincasa hispida（Thunb.） Cogn.的干燥果皮。采用烘箱加熱制炭，即將冬瓜皮放到托盤(pán)上（平鋪1 cm） 置于烘箱中，制炭溫度280 ℃，制炭時(shí)間15 min，粉碎，?。?0目、＞100 目的細(xì)粉，用時(shí)加雙蒸水配制成3%、4.5%、6%混懸液。

1.2 動(dòng)物 SPF 級(jí)Wistar 雄性大鼠72 只，體質(zhì)量160～180 g，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（粵）2016-0167。

1.3 試劑 腺嘌呤（上海索寶科技有限公司，批號(hào)A8330），用時(shí)加蒸餾水配制成2.5%混懸液，置于4 ℃冰箱中，混勻后使用；肌酐試劑盒（批號(hào)D170214）、尿素氮試劑盒（批號(hào)L160333） （上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司）； TGF-β1、 PAI-1 ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)150321、160088），NF-κB p65 兔抗大鼠一抗（abcam）。愛(ài)西特（藥用炭片，河北長(zhǎng)天藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H13022797）。

1.4 儀器 DHG-9076A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Bio-Rad 680 酶標(biāo)儀、PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）；移液器、高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；Labcycler 定量PCR 擴(kuò)增儀（德國(guó)SensoQuest 公司）。

2 方法

2.1 分組及造模 72 只大鼠隨機(jī)取12 只作為正常組，灌胃給予250 mg／kg 蒸餾水；其余大鼠灌胃給藥250 mg／kg 2.5%腺嘌呤混懸液，第1～14 天每天1 次，第15～28 天隔天1 次。第29 天，將造模大鼠隨機(jī)分為模型組、 愛(ài)西特組 （450 mg／kg）及冬瓜 皮 炭 低、 中、 高 劑 量 組 （300、 450、600 mg／kg）。

2.2 給藥 造模結(jié)束后， 愛(ài)西特組大鼠按450 mg／kg劑量灌胃，冬瓜皮炭高、中、低劑量組大鼠分別按600、450、300 mg／kg 劑量灌胃；正常組、模型組大鼠按等體積蒸餾水灌胃，制作大鼠體質(zhì)量（g） 與給藥量（mL） 對(duì)照表，每2 d 稱1 次體質(zhì)量，按其變化增減給藥量，持續(xù)15 d，其間大鼠自由攝食、飲水。

2.3 BUN、Scr、TGF-β1、PAI-1 水平檢測(cè) 第15天給藥1 h 后， 各組大鼠用1%戊巴比妥鈉（0.01 mL／g） 麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 mL，3 000 r／min離心15 min，分離血清，按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)BUN、SCr、TGF-β1、PAI-1 水平。

2.4 病理形態(tài)變化觀察 取大鼠腎臟作石蠟切片，分別進(jìn)行HE 染色（蘇木素染色液染色10 min，浸入自來(lái)水中洗去多余染色液，約10 min，蒸餾水再洗滌1 次，95%乙醇浸泡5 s，伊紅染色液染色2 min）、Masson 染色，光鏡下觀察大鼠腎組織病理形態(tài)變化。

2.5 NF-κB p65、 I-κB mRNA 表達(dá)檢測(cè) 按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)提取大鼠腎組織總RNA，并將其質(zhì)量濃度調(diào)至1 μg／μL，-80 ℃下保存，引物序列由PrimerPrimier5.0 軟件設(shè)計(jì)，生工生物工程（上海） 股份有限公司合成引物，NF-κB p65 正向5′-TGATGTGCATCTTGAGC-3′， 反 向 5′-GTTGAAGAGAATCGCGTACGC-3′，298 bp； I-κB 正向5′-TGGAGCCGAGGTCAATATAGC-3′， 反 向5′-TGGCACTGTGTACCAGCAAG-3′，320 bp； β-actin 正向 5′-TGCTGAGATTGTGCTGCAGT-3′， 反 向 5′-AGTCAGCTGAGTCGCACTGTT-3′， 290 bp。 采 用SYBR Green 法進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)， 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，59 ℃退火、延伸60 s，40 個(gè)循環(huán)。以內(nèi)參β-actin 表達(dá)量為參照，進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2.6 NF-κB p65 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法。將蛋白樣品取出后解凍，加入等體積2×SDS上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min 進(jìn)行變性，加樣量為40 μg／孔，經(jīng)SDS／PAGE 凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDE 膜，封閉，加入一抗（NF-κB p65 抗體稀釋1 ∶200），4 ℃下孵育過(guò)夜，再與1 ∶10 000 稀釋的二抗室溫下孵育2 h，顯色劑顯色1 min，蒸餾水洗滌后保存圖像，凝膠圖像分析成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。以β-actin 為內(nèi)參，NF-κB p65 與β-actin 的面積光密度比值表示蛋白表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 冬瓜皮炭對(duì)BUN、SCr、TGF-β1、PAI-1 水平的影響 表1 顯示，與正常組比較，模型組BUN、SCr、TGF-β1、PAI-1 水平顯著升高 （P ＜0.01）；與模型組比較， 冬瓜皮炭高劑量組BUN、 SCr、TGF-β1、PAI-1 水平顯著降低，中劑量組BUN、SCr 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 冬瓜皮炭對(duì)BUN、SCr、TGF-β1、PAI-1 水平的影響n＝12）Tab.1 Effects of Benincasae Exocarpium charcoal on BUN，SCr，TGF-β1 and PAI-1 levels，n＝12）

表1 冬瓜皮炭對(duì)BUN、SCr、TGF-β1、PAI-1 水平的影響n＝12）Tab.1 Effects of Benincasae Exocarpium charcoal on BUN，SCr，TGF-β1 and PAI-1 levels，n＝12）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別 劑量／（mg·kg-1） BUN／（mmol·L-1） SCr／（μmol·L-1） TGF-β1／（pg·mL-1） PAI-1／（pg·mL-1）正常組 — 6.22±1.13 70.83±11.128 51.34±13.02 9.79±1.85模型組 — 28.15±5.11** 171.02±21.33** 120.22±24.03** 22.87±5.81**陽(yáng)性對(duì)照組 450 12.45±2.06＃ 89.41±22.67＃＃ 60.08±1.21＃＃ 10.82±3.51＃＃冬瓜皮炭低劑量組 300 27.31±5.21 160.43±11.81 111.41±23.04 21.42±6.01冬瓜皮炭中劑量組 450 15.86±3.27＃ 93.34±23.42＃ 108.54±24.01 19.98±4.78冬瓜皮炭高劑量組 600 10.01±4.18＃ 86.78±20.32＃＃ 58.09±20.14＃＃ 9.84±1.23＃＃

3.2 大鼠腎組織病理變化 圖1 顯示，模型組大鼠局灶性間質(zhì)纖維化，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)重度纖維化增生，腎小囊腔明顯擴(kuò)張；愛(ài)西特組、冬瓜皮炭高劑量組大鼠腎小管輕度擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞輕度空泡樣變性，腎間質(zhì)輕度纖維化，腎間質(zhì)可見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小囊腔輕度擴(kuò)張，其中后一組囊腔擴(kuò)張程度更低，組織學(xué)變化更少。圖2 顯示，模型組大鼠腎小管腎間質(zhì)重度纖維化，擴(kuò)張腎小管?chē)?yán)重；冬瓜皮炭高劑量組大鼠腎間質(zhì)輕度纖維化，腎小管、腎小囊腔輕度擴(kuò)張。

3.3 冬瓜皮炭對(duì)NF-κB p65、I-κB mRNA 表達(dá)的影響 表2 顯示，與正常組比較，模型組NF-κB p65、I-κB mRNA 的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，冬瓜皮炭高劑量組兩者mRNA 表達(dá)顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 冬瓜皮炭對(duì)NF-κB p65、I-κB mRNA 表達(dá)的影響（，n＝12）Tab.2 Effects of Benincasae Exocarpium charcoal on NF-κB p65 and I-κB mRNA expressions（，n＝12）

表2 冬瓜皮炭對(duì)NF-κB p65、I-κB mRNA 表達(dá)的影響（，n＝12）Tab.2 Effects of Benincasae Exocarpium charcoal on NF-κB p65 and I-κB mRNA expressions（，n＝12）

注：與正常組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01

組別 （m劑g·量kg／-1） NF-κB p65 I-κB正常組 — 1.00±0.00 1.00±0.00模型組 — 3.55±0.36* 3.27±0.22*陽(yáng)性對(duì)照組 450 1.21±0.02＃ 2.23±0.05＃冬瓜皮炭低劑量組 300 3.45±0.23 3.12±0.13冬瓜皮炭中劑量組 450 3.18±0.14 3.19±0.14冬瓜皮炭高劑量組 600 1.02±0.04＃＃ 1.07±0.11＃＃

圖1 各組大鼠HE 染色（×400）Fig.1 HE staining of rats in various groups（×400）

3.4 冬瓜皮炭對(duì)NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響 表3、圖3 顯示，與正常組比較，模型組NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，冬瓜皮炭高劑量組其蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠Massion 染色（×400）Fig.2 Massion staining of rats in various groups（×400）

表3 冬瓜皮炭對(duì)NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響n＝12）Tab.3 Effect of Benincasae Exocarpium charcoal on NF-κB p65 protein expression，n＝12）

表3 冬瓜皮炭對(duì)NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響n＝12）Tab.3 Effect of Benincasae Exocarpium charcoal on NF-κB p65 protein expression，n＝12）

注：與模型組比較，＃P＜0.05

組別 劑量／（mg·kg-1） NF-κB p65正常組 — 0.43±0.02＃模型組 — 1.31±0.01陽(yáng)性對(duì)照組 450 0.59±0.01＃冬瓜皮炭高劑量組 600 0.66±0.02＃

圖3 各組NF-κB p65 蛋白表達(dá)Fig.3 NF-κB p65 protein expressions in various groups

4 討論

慢性腎功能衰竭可對(duì)腎組織產(chǎn)生漫長(zhǎng)性、進(jìn)行性的實(shí)質(zhì)性、功能性損害，從而導(dǎo)致不同組織、生化、內(nèi)分泌等全身代謝紊亂組成的臨床綜合征，具有不可逆轉(zhuǎn)的特征，癥狀包括腎小球?yàn)V過(guò)率下降、腎臟代謝發(fā)生紊亂，最終誘發(fā)終末期腎病和腎功能進(jìn)一步惡化，患者需要終身依賴腎臟透析或腎臟移植才能獲得生存的權(quán)利，我國(guó)成年人中發(fā)病率達(dá)10.8%，需要及時(shí)預(yù)防和診治［6-7］。

上個(gè)世紀(jì)七十年代，吸附劑在慢性腎衰治療中的作用引起了人們重視，相關(guān)新型吸附劑的研究也有所進(jìn)展。其中，愛(ài)西特由活性炭制備，主要通過(guò)物理作用將病理情況下機(jī)體無(wú)法排泄、分子量較小的血肌酐、尿素氮等代謝廢物進(jìn)入其孔隙中，經(jīng)貯存作用使這些物質(zhì)不留體內(nèi)循環(huán)，減少對(duì)腎臟功能損害，最終和愛(ài)西特一起排出體外，起到改善初期腎功能病理狀態(tài)、延緩衰竭進(jìn)展、降低終末期腎衰竭發(fā)生率等作用［8］。臨床顯示，愛(ài)西特能緩解代償期慢性腎衰竭患者臨床癥狀，降低血肌酐水平，故本實(shí)驗(yàn)以愛(ài)西特為陽(yáng)性藥。但口服吸附劑存在以下不足：吸附物靶向性差，如活性炭類(lèi)；吸附容量低，需同時(shí)服用幾種吸附劑，導(dǎo)致不良反應(yīng)發(fā)生，醫(yī)療費(fèi)用增加；生物相容性較差。因此，設(shè)計(jì)合成吸附容量高、生物相容性好的復(fù)合型口服吸附劑十分迫切。

慢性腎衰竭的主要病理形態(tài)為正常腎臟組織結(jié)構(gòu)被成纖維細(xì)胞及其分泌的纖維連接蛋白、層粘連蛋白等所替代，腎臟結(jié)構(gòu)受到破壞和侵襲，進(jìn)而其功能受到損害，不能起到正常代謝作用，逐步喪失排泄廢物，維持水電解質(zhì)、酸堿平衡等正常功能。腎組織纖維化和硬化與TGF-β1、PAI-1 蛋白表達(dá)密切相關(guān)，前者通過(guò)上調(diào)DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1 的表達(dá)，促使與成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)相關(guān)因子Rasal 1 的DNA 啟動(dòng)子區(qū)域形成高甲基化，成纖維細(xì)胞失去抑制控制，高甲基化后不斷增殖活化；后者在組織內(nèi)表達(dá)的增加能抑制腎組織中纖維蛋白水解，增加纖維蛋白沉積，導(dǎo)致組織器官纖維化加強(qiáng)［9-10］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠體內(nèi)堆積代謝物BUN、SCr水平顯著升高，表明腎臟失去了排泄代謝廢物的能力，腎臟功能進(jìn)一步惡化；TGF-β1、PAI-1 水平顯著升高，表明腎臟進(jìn)一步纖維化和硬化，形成纖維化的病理特征。

氧化應(yīng)激作用在慢性腎衰竭惡化中起著重要作用，腎小管受到氧化損傷后，當(dāng)代謝產(chǎn)物堆積、機(jī)體氧化應(yīng)激啟動(dòng)時(shí)，活性氧活性增強(qiáng)，促使NF-κB信號(hào)途徑活化，進(jìn)而啟動(dòng)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，最后正常上皮細(xì)胞失去正常極性，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡、降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型，纖維化愈加嚴(yán)重，最終導(dǎo)致終末期腎衰竭發(fā)生，腎功能完全喪失，故遏制NF-κB 信號(hào)通路可減少纖維化的發(fā)生［11-12］。NF-κB 的經(jīng)典激活途徑與其蛋白家族中的p65 和p50 有關(guān)，只有前者在蛋白的C 末端才含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，故本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其表達(dá)以考察激活途徑；I-κB 作為細(xì)胞內(nèi)主要抑制NF-κB 表達(dá)的因子，通過(guò)與NF-κB 二聚體結(jié)合來(lái)調(diào)控NF-κB／I-κB 信號(hào)應(yīng)答，故檢測(cè)其表達(dá)可以了解其抑制途徑如何作用；NF-κB 在腎小球上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞等細(xì)胞中廣泛存在，并在腎小球腎炎、腎毒性損害、腎臟疾病等腎臟病理過(guò)程中調(diào)控TNF-α、IL-1、IL-1β、IFN 等炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，在代謝產(chǎn)物堆積后進(jìn)一步加深氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)腎臟的損傷［13-14］。本實(shí)驗(yàn)顯示，模型組NF-κB mRNA、蛋白表達(dá)及I-κB mRNA 表達(dá)上調(diào)，表明NF-κB 信號(hào)通路被激活，腎臟損傷進(jìn)一步加深，大量腎小管上皮細(xì)胞凋亡、壞死、脫落或空泡樣變性，高度擴(kuò)張者與萎縮者并存，腎間質(zhì)重度纖維化增生， 可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

與模型組比較，冬瓜皮炭高劑量組血清尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、TGF-β1、PAI-1 水平明顯下降；腎小管輕度擴(kuò)張，腎間質(zhì)輕度纖維化，腎小囊腔輕度擴(kuò)張，腎小球系膜細(xì)胞增生不明顯，表明它可明顯改善腎組織病理形態(tài)，恢復(fù)正常組織形態(tài)；NF-κB p65 亞基mRNA 和蛋白表達(dá)顯著降低，I-κB mRNA 表達(dá)顯著下降，與正常組無(wú)明顯差異，表明它除了起到吸附作用以外，還可通過(guò)作用于NF-κB 信號(hào)通路來(lái)阻斷氧化應(yīng)激對(duì)腎臟的刺激作用，維護(hù)腎臟正常功能。

綜上所述，冬瓜皮炭能明顯降低慢性腎功能衰竭大鼠腎臟氮質(zhì)代謝產(chǎn)物，糾正酸中毒，改善腎臟病理變化，可能與干預(yù)NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)。