馮慶濤， 楊 靜， 張 燕， 呂尚增， 苗華為

（河北省中醫(yī)院，河北 石家莊050011）

慢性心衰是由多因素所致的病理過程［1］，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療過程中顯示出整體辨證和調節(jié)的獨特優(yōu)勢。補益強心片是由人參、黃芪、五加皮等組成的復方中藥制劑，臨床上用于治療冠心病、高血壓性心臟病所致慢性充血性心力衰竭［2-3］，并在《慢性心力衰竭中醫(yī)診療專家共識》 中推薦用于慢性心衰患者的治療。

PI3K-Akt 信號通路是與細胞生長、增殖密切相關的一條典型信號轉導通路，激活后可抑制細胞凋亡，改善心臟功能［4］。本實驗通過結扎心臟左冠狀動脈前降支的方法制備慢性心力衰竭大鼠模型，觀察補益強心片對其作用，并初步探討該制劑對PI3K-Akt 信號通路及凋亡的影響，從而為其臨床用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 雄性SD 大鼠60 只，體質量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京） 2016-0011。實驗期間大鼠于籠中飼養(yǎng)，每籠5 只，每天光照12 h，溫度20 ～26 ℃，相對濕度40%～70%。

1.2 試藥 補益強心片購自蘇州滋露藥業(yè)有限公司（國藥準字Z20050077）。大鼠N-端前腦鈉肽（BNP）、大鼠N-端前心鈉肽 （ANP） 酶聯(lián)免疫（ELISA） 試劑盒購自上海易利生物科技有限公司；B 細胞白血?。馨土隹乖?2（Bcl-2）、白血?。馨土隹乖嚓PX 蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase-3）、磷脂酰肌醇-3 羥基激酶（PI3K） 及磷酸化（p-PI3K）、絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（Akt） 及磷酸化（p-Akt） 兔多克隆抗體均購自英國Abcam 公司。

1.3 儀器 POWERLAB-420E 生理記錄儀購自澳大利亞ADInstruments 公司；HX-300 動物呼吸機購自成都泰盟科技有限公司；小動物超聲儀超聲診斷系統(tǒng)購自意大利百勝集團公司；Epics XL 流式細胞儀購自美國Beckman Coulter 公司；SpectraMax M2酶標儀購自美國分子儀器公司；ABI 300 熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司。

2 方法

2.1 分組及給藥 60 只大鼠隨機為正常對照組、假手術組、模型組及補益強心片低、中、高劑量組（0.18、0.36、0.72 g／kg）， 每組10 只。 手術后24 h開始給藥，補益強心組大鼠每天灌胃給藥，持續(xù)4 周，藥物分別用純水配制成0.018、0.036、0.072 g／mL 混懸液，而正常對照組、假手術組、模型組大鼠灌胃給予等體積純水，各組給藥量均為1 mL／100 g。

2.2 模型建立［5］大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，仰臥位固定，連接生理記錄儀，經(jīng)口氣管插管，連接動物呼吸機，打開胸腔，第2、3 肋骨之間鈍性分離胸膜，在左心耳下與肺動脈根部約1.5 mm 處迅速穿線結扎左冠狀動脈前降支，關閉胸腔后縫合，生理記錄儀可觀察到ST-T 弓背上抬，提示造模成功；假手術組大鼠只穿線而并不結扎；正常對照組大鼠不作任何處理。

2.3 血流動力學參數(shù)檢測 給藥結束后，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，仰臥位固定，備皮，應用超聲儀超聲診斷系統(tǒng)，二維超聲引導，根據(jù)心室波群的M 型曲線測量大鼠左室舒張末期內徑（LVEDd）、左室收縮末期內徑（LVESd）、射血分數(shù)（LVEF）。

2.4 BNP、ANP 水平檢測 采用ELISA 法。大鼠頸動脈取血，離心后取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書步驟操作， 酶標儀測定OD 值， 計算BNP、ANP 水平。

2.5 心肌細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。取大鼠心臟左室壁心肌組織，剪碎后充分研磨，PBS緩沖液洗滌， 加入膜聯(lián)蛋白 V 和碘化丙啶（Annexin V-PI） 進行聯(lián)合染色，混勻后置于冰浴中溫育，上機檢測凋亡率，流式細胞儀激發(fā)光波長為488 nm。

2.6 大鼠心肌Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA 表達檢測 采用RT-PCR 法。取大鼠心臟左室壁心肌組織，加入Trizol Reagent 冰浴勻漿，離心，提取總RNA，按試劑盒要求進行反轉錄，加入引物等反應體 系， PCR 儀 擴 增。 Bcl-2 正 向5′-GGATGACTTCTCTCGTCGCTAC-3′， 反 向5′-TGACATCTCCCTGTTGACGCT-3′，產(chǎn)物片段100 bp；Bax 正向5′-GGTTGCCCTCTTCTACTTTGC-3′， 反 向 5′-TCTTCCAGATGGTGAGCGAG-3′， 產(chǎn) 物 片 段 239 bp；caspase-3 正向5′-GCGGTATTGAGACAGACAGTG-3′，反向5′-GGGTGCGGTAGAGTAAGCATA-3′，產(chǎn)物片段95 bp； 內 參GAPDH 正 向5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3′， 反 向 5′-TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC-3′，產(chǎn)物片段143 bp。采用RT-PCR 自帶的分析軟件，將正常對照組設定為1，以目的基因／GAPDH 相對定量值反映目的基因表達。

2.7 大鼠心肌Bcl-2、Bax、caspase-3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達檢測 采用Western blot 法。取大鼠心臟左室壁心肌組織，加入預冷的組織裂解液充分勻漿，離心后取上清，BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳變性，將分離蛋白經(jīng)轉移裝置轉移至膜，PVDF膜在脫脂奶粉溶液中孵育， 加入一抗或內參GAPDH 進行抗原抗體結合，再加入相應二抗以結合一抗，采用化學發(fā)光法，X 膠片曝光顯影，分析軟件將掃描圖片進行條帶灰度值數(shù)字化，以Bcl-2、Bax、caspase-3、PI3K、 p-PI3K、 Akt、 p-Akt 灰度值／GAPDH 灰度值來校正誤差，所得比值反映目的蛋白相對表達。

2.8 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 11.5 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（） 表示，2 組間比較采用SNK-q 法，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 補益強心片對血流動力學參數(shù)的影響 表1、圖1 顯示， 與假手術組比較， 模型組LVEDd、LVESd 顯著升高，LVEF 顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，補益強心片低劑量組LVESd 顯著降低，LVEF 顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），中、高劑量組LVEDd、LVESd 顯著降低，LVEF 顯著升高（P＜0.01）。

表1 各組血流動力學參數(shù)比較（，n＝10）Tab.1 Comparison of hemodynamic parameters among various groups（，n＝10）

表1 各組血流動力學參數(shù)比較（，n＝10）Tab.1 Comparison of hemodynamic parameters among various groups（，n＝10）

注：與假手術組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） LVEDd／mm LVESd／mm LVEF／%正常對照組 — 5.33±0.91 3.21±0.68 79.02±9.22假手術組 — 5.41±0.93 3.29±0.73 72.59±10.08模型組 — 7.89±1.14＃＃ 7.11±1.23＃＃ 35.16±7.39＃＃補益強心片低劑量組 0.18 6.79±1.18 5.91±0.97* 47.41±6.26**補益強心片中劑量組 0.36 6.28±0.93** 5.86±0.81* 53.87±7.08**補益強心片高劑量組 0.72 6.12±0.89** 5.15±0.77** 57.81±7.79**

3.2 補益強心片對BNP、ANP 水平的影響 表2顯示，與假手術組比較，模型組BNP、ANP 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，補益強心片組兩者水平顯著降低（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠超聲心電圖Fig.1 Ultrasonic lectrocardiograms of rats in various groups

表2 各組BNP、ANP 水平比較（n＝10）Tab.2 Comparison of BNP and ANP levels among various groups，n＝10）

表2 各組BNP、ANP 水平比較（n＝10）Tab.2 Comparison of BNP and ANP levels among various groups，n＝10）

注：與假手術組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組別 （g劑·k量g-／1） （n B g·NLP-／1） （n A g·NLP-／1）正常對照組 — 125.86±23.27 35.89±6.01假手術組 — 127.05±19.35 38.54±6.30模型組 — 265.57±30.72＃＃ 69.05±9.52＃＃補益強心片低劑量組 0.18 182.72±20.27** 52.84±8.87**補益強心片中劑量組 0.36 167.48±19.33** 49.27±8.59**補益強心片高劑量組 0.72 165.81±19.22** 48.89±7.08**

3.3 補益強心片對細胞凋亡率的影響 表3、圖2顯示，與假手術組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，補益強心片組其凋亡率顯著降低（P＜0.01）。

表3 各組細胞凋亡率比較，n＝10）Tab.3 Comparison of cell apoptosis rates among various groupsn＝10）

表3 各組細胞凋亡率比較，n＝10）Tab.3 Comparison of cell apoptosis rates among various groupsn＝10）

注：與假手術組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） 凋亡率／%正常對照組 — 5.23±1.11假手術組 — 6.01±1.08模型組 — 13.05±2.19＃＃補益強心片低劑量組 0.18 10.23±2.05**補益強心片中劑量組 0.36 9.44±1.38**補益強心片高劑量組 0.72 8.19±1.03**

3.4 補益強心片對Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表達的影響 表4～5、圖3 顯示，與假手術組比較，模型組Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA 和蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，補益強心片組Bcl-2 mRNA 和蛋白表達顯著升高，Bax、Caspase-3 mRNA 和蛋白表達顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 各組Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA 表達比較n＝5）Tab.4 Comparison of Bcl-2，Bax and caspase-3 mRNA expressions among various groupsn＝5）

表4 各組Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA 表達比較n＝5）Tab.4 Comparison of Bcl-2，Bax and caspase-3 mRNA expressions among various groupsn＝5）

注：與假手術組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） Bcl-2 Bax caspase-3正常對照組 — 0.96±0.16 1.03±0.14 0.89±0.09假手術組 — 1.02±0.17 1.09±0.21 0.93±0.11模型組 — 1.21±0.18＃＃ 2.89±0.23＃＃ 3.01±0.37＃＃補益強心片低劑量組 0.18 1.55±0.21* 1.92±0.19** 2.19±0.21**補益強心片中劑量組 0.36 2.13±0.25** 1.69±0.17** 1.95±0.28**補益強心片高劑量組 0.72 2.91±0.28** 1.51±0.15** 1.68±0.19**

圖2 各組大鼠細胞凋亡圖Fig.2 Cell apoptosis maps of rats in various groups

表5 各組Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表達比較（n＝5）Tab.5 Comparison of Bcl-2，Bax and caspase-3 protein expressions among various groups（，n＝5）

表5 各組Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表達比較（n＝5）Tab.5 Comparison of Bcl-2，Bax and caspase-3 protein expressions among various groups（，n＝5）

注：與假手術組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） Bcl-2 Bax caspase-3正常對照組 — 0.34±0.06 0.29±0.04 0.41±0.05假手術組 — 0.36±0.07 0.22±0.03 0.45±0.07模型組 — 0.48±0.07＃＃ 0.93±0.20＃＃ 1.09±0.15＃＃補益強心片低劑量組 0.18 0.54±0.09 0.71±0.15** 0.79±0.11**補益強心片中劑量組 0.36 0.62±0.15* 0.66±0.12** 0.75±0.18**補益強心片高劑量組 0.72 0.71±0.13** 0.42±0.05** 0.60±0.08**

圖3 各組大鼠心肌組織免疫印跡條帶圖Fig.3 Immunoblot band diagrams for rat myocardial tissues in various groups

3.5 補益強心片對p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt 的影響 表6、圖3 顯示，與假手術組比較，模型組p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt 顯著降低（P ＜0.01）；與模型組比較，補益強心片組兩者顯著升高 （P ＜0.01）。

表6 各組p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt 水平比較 n＝5）Tab.6 Comparison of p-PI3K／PI3K and p-Akt／Akt levels among various groups，n＝5）

表6 各組p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt 水平比較 n＝5）Tab.6 Comparison of p-PI3K／PI3K and p-Akt／Akt levels among various groups，n＝5）

注：與假手術組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組別 （g劑·k量g-／1） p-PI3K／PI3K p-AKT／AKT正常對照組 — 0.69±0.13 0.91±0.15假手術組 — 0.65±0.18 0.93±0.20模型組 — 0.21±0.04＃＃ 0.22±0.03＃＃補益強心片低劑量組 0.18 0.37±0.06** 0.42±0.05**補益強心片中劑量組 0.36 0.54±0.09** 0.66±0.12**補益強心片高劑量組 0.72 0.59±0.11** 0.71±0.15**

4 討論

導致慢性心力衰竭的病因很多，其中心肌梗死所致心力衰竭是重要促發(fā)因素，發(fā)生率高達32%～48%［6-7］。本實驗采用結扎心臟左冠狀動脈前降支的方法制備急性心肌梗死大鼠模型，4 周后測定其心功能參數(shù)，發(fā)現(xiàn)心室腔擴大，心尖區(qū)或心前壁變薄，LVEDd、LVESd 明顯升高，左室射血分數(shù)降低至45%以下，表明造模成功［8］。補益強心片由人參、黃芪、五加皮、丹參、麥冬、葶藶子組成［2］，其中人參具有大補元氣、復脈固脫之功效［9］，黃芪具有益腎補血、泄虛補陽之功效，五加皮具有補中益精、堅筋骨之功效，葶藶子具有行水化痰、理肝順氣之功效，給予該制劑后大鼠心室腔明顯縮小，LVEDd、LVESd 降低，射血分數(shù)升高，表明它能改善慢性心衰大鼠心功能。

心鈉肽（ANP）、腦鈉肽（BNP） 是心臟分泌的重要多肽類激素，在正常生理狀態(tài)下機體少量分泌，而急性心肌梗死后心肌細胞會合成釋放大量該激素，故檢測兩者水平對心力衰竭診斷、治療、預后評估至關重要［10］，與慢性心衰嚴重程度密切相關［11］。本實驗發(fā)現(xiàn)，慢性心力衰竭大鼠血漿中ANP、BNP 水平高于正常組2 倍以上，；給予補益強心片后，它能在很大程度上降低兩者水平。

PI3K-Akt 信號通路是生命活動中的關鍵信號分子，也是許多效應分子（如胰島素、生長因子等） 共用的信號轉導通路，參與機體多種細胞生長、分化、凋亡等［12-13］，被認為是一條重要的內源性心肌肥大調節(jié)通路［14］，心肌梗死后缺血缺氧，誘導心肌細胞凋亡，平滑肌細胞異常增生，心臟正常結構及功能極大受損；PI3K 被激活后，能使其下游信號分子Akt 磷酸化為p-Akt，轉膜至細胞核，發(fā)揮抑制細胞凋亡、促進生長、維持細胞生存等功能。本實驗發(fā)現(xiàn)，補益強心片能降低細胞凋亡率，抑制凋亡因子Bax、caspase-3 表達，升高Bcl-2 表達，p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt 比值升高， 表明它可激活PI3K-Akt 信號通路，抑制心衰后的心肌細胞凋亡及Bax、caspase-3 表達，上調Bcl-2 表達，從而發(fā)揮心肌保護作用。