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        柚皮素納米混懸劑的制備及其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為

        2019-10-16 12:47:54裴巖巖閆春生牛美蘭郭志剛
        中成藥 2019年9期

        裴巖巖, 閆春生, 牛美蘭, 郭志剛

        (黃河科技學(xué)院,河南 鄭州450005)

        柚皮素是一種二氫黃酮類化合物,廣泛存在于蕓香科植物中,具有抗病毒、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)咳、抗腫瘤、抗纖維化、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等多種藥理活性[1-3],顯示出巨大的潛在利用價(jià)值,但其溶解度不理想[4],導(dǎo)致體內(nèi)吸收較差,口服后藥效大打折扣[5]。

        目前,納米制劑技術(shù)包括固體脂質(zhì)納米粒[6]、脂質(zhì)體[7]、 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體[8]、自微乳等[9],但都存在一定問題,如制備工藝復(fù)雜、載藥量較低等。納米混懸劑是指難溶性藥物通過濕磨、均質(zhì)勻化等制劑技術(shù)制備而成的一種“純” 藥物膠態(tài)分散體系[10-13],其制備工藝和處方簡單,載藥量大,適合工業(yè)化生產(chǎn),有助于增加藥物溶解度、促進(jìn)藥物吸收、提高生物利用度等,從而擴(kuò)大臨床應(yīng)用范圍。因此,本實(shí)驗(yàn)制備柚皮素納米混懸劑,并考察其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為,為相關(guān)制劑研發(fā)提供參考。

        1 材料

        Agilent 1260 型高效液相色譜儀(配置DAD 檢測器,美國Agilent 公司); AR2140 型電子天平[梅特勒-托利多儀器 (上海) 有限公司]; DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);VORTEX-5 型渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);ATS 型均質(zhì)機(jī)(加拿大Seeker 公司);RE5299 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);MD200-2 型氮?dú)獯祾邇x(杭州奧威儀器有限公司);Master-sizer 型粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)。

        柚皮素原料藥 (批號20170223, 含有量98.7%,西安瑞迪生物科技有限公司);柚皮素對照品(批號Y-034-181217,成都瑞芬思生物科技有限公司);卵磷脂(批號PC-98T,輔必成上海醫(yī)藥科技有限公司);聚乙烯吡咯烷酮K30 (PVP K30,批號25000240379,亞什蘭集團(tuán)公司);肝素鈉(批號20160511S,新泰市朝陽生化研究所)。

        清潔級SD 大鼠,雌雄兼用,體質(zhì)量(300±20) g, 河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心, 動(dòng)物許可證號SCXK(豫)2016-0001。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 柚皮素含有量測定

        2.1.1 色譜條件 Diamonsil BDS-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相甲醇-水(65 ∶35);體積流量1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長287 nm;進(jìn)樣量20 μL。

        2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取柚皮素對照品20.00 mg,加入50 mL 甲醇溶解,得400.0 μg/mL貯備液,甲醇稀釋成200.0、100.0、50.0、10.0、1.0 μg/mL,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積(Y) 對溶液質(zhì)量濃度(X) 進(jìn)行回歸,得方程為Y =40.056 3X+4.125 7(R2=0.999 4),在1.0~200.0 μg/mL 范圍線性關(guān)系良好。

        2.1.3 供試品溶液制備 精密量取納米混懸液0.5 mL,加入10 mL 甲醇超聲5 min,即得。

        2.1.4 方法學(xué)考察 取供試品溶液,于0、4、8、12、24、48 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,測得柚皮素峰面積RSD 為0.64%,表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取1.0、100.0、200.0 μg/mL 對照品溶液,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,連續(xù)6 d,測得日內(nèi)精密度RSD 均小于0.52%,日間精密度RSD 均小于1.33%,表明該方法精密度良好。平行制備6 份供試品溶液,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,測得柚皮素峰面積RSD 為1.39%,表明該方法重復(fù)性良好??瞻准{米混懸液分別配制成40、60、80 μg/mL,在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,測得柚皮素平均加樣回收率為99.36%,RSD小于1.80%。取對照品溶液逐步稀釋,測得檢測限為0.5 ng/mL,定量限為1.2 ng/mL。

        2.2 單因素試驗(yàn)

        2.2.1 表面活性劑種類 在制備溫度25 ℃、均質(zhì)壓力60 MPa、均質(zhì)次數(shù)10 次的條件下,考察PVP K30、卵磷脂、兩者混合物(1 ∶1) 對納米粒粒徑的影響。結(jié)果,平均粒徑分別為(281.42±5.93)、(224.79±6.07)、 (182.50±4.11) nm, 故選擇PVP K30-卵磷脂混合物(1 ∶1) 作為表面活性劑。

        2.2.2 制備溫度 在表面活性劑PVP K30-卵磷脂(1 ∶1)、均質(zhì)壓力60 MPa、均質(zhì)次數(shù)10 次的條件下,考察制備溫度0、25、50 ℃對納米粒粒徑的影響,結(jié)果見圖1。由圖可知,在0 ℃時(shí)粒徑最小,故選擇其作為制備溫度。

        圖1 制備溫度對粒徑的影響Fig.1 Effect of preparation temperature on particle size

        2.2.3 均質(zhì)壓力 在表面活性劑PVP K30-卵磷脂(1 ∶1)、制備溫度0 ℃、均質(zhì)次數(shù)為10 次的條件下,考察均質(zhì)壓力40、60、80、100 MPa 對納米粒粒徑的影響,結(jié)果見圖2。由圖可知,在均質(zhì)壓力40 ~80 MPa 范圍內(nèi)粒徑逐漸變小, 但增大至100 MPa時(shí)反而上升,故選擇80 MPa 作為均質(zhì)壓力。

        圖2 均質(zhì)壓力對粒徑的影響Fig.2 Effect of homogenization pressure on particle size

        2.2.4 均質(zhì)次數(shù) 在表面活性劑PVP K30-卵磷脂(1 ∶1)、制備溫度0 ℃、均質(zhì)壓力80 MPa 的條件下,考察均質(zhì)次數(shù)6、8、10、12、15、20 次對納米粒粒徑的影響,結(jié)果見圖3。由圖可知,隨著均質(zhì)次數(shù)增加粒徑逐漸減小,在12 次時(shí)最小,而15、20 次時(shí)略有變大趨勢,故選擇12 次作為均質(zhì)次數(shù)。

        圖3 均質(zhì)次數(shù)對粒徑的影響Fig.3 Effect of homogenization frequency on particle size

        2.3 納米混懸劑制備 根據(jù)“2.2” 項(xiàng)下結(jié)果,確定最優(yōu)制備工藝為取50 mg 柚皮素溶于5 mL 無水乙醇中,作為溶液A;稱取泊洛沙姆、卵磷脂各0.1 g,加入50 mL 蒸餾水溶解,作為溶液B,在制備溫度0 ℃、轉(zhuǎn)速800 r/min 的條件下,將溶液A 緩慢滴加到溶液B 中,旋蒸約30 min 以除去乙醇,濃縮后體積約為40 mL,在80 MPa 均質(zhì)壓力下均質(zhì)12 次,即得。

        2.4 粒徑、PDI、Zeta 電位測定 取納米混懸劑100 μL,3.5 mL 蒸餾水稀釋,測定粒徑、PDI、Zeta 電位,平行6 次,取平均值,測得三者分別為(161.67±4.23) nm、0.105±0.011、 (-30.47±1.15) mV。見圖4~5。

        圖4 納米混懸劑粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of nanosuspensions

        圖5 納米混懸劑Zeta 電位Fig.5 Zeta potential of nanosuspensions

        2.5 凍干粉制備 取納米混懸液若干份,每份4 mL,以5%甘露醇-乳糖(3 ∶2) 為凍干保護(hù)劑,按照表1 程序進(jìn)行預(yù)凍、升華、解析,即得納米混懸液凍干粉。取0.2 g,0.5 mL 蒸餾水復(fù)溶,按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定,測得含有量為2.22%,再按照納米混懸劑處方比例稱取柚皮素、輔料,加入蒸餾水、6%甘露醇-乳糖(3 ∶2),同法凍干,即得物理混合物凍干粉。

        表1 凍干粉凍干程序Tab.1 Freeze-drying procedure for freeze-dried powder

        2.6 體外釋藥行為 取納米混懸劑、物理混合物凍干粉各 0.2 g (以柚皮素計(jì), 含有量為4.44 mg),裝入膠囊,按2015 年版《中國藥典》四部0931 項(xiàng)下二法進(jìn)行考察,溫度(37±1)℃,轉(zhuǎn)速100 r/min,溶出介質(zhì)100 mL 超聲水,于0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min 各取樣3.0 mL,并補(bǔ)足至3.0 mL,溶液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾,HPLC 法測定柚皮素含有量,計(jì)算累積釋放度,繪制溶出曲線,見圖6。由圖可知,納米混懸劑凍干粉在40 min 時(shí)基本完全溶出,而物理混合物凍干粉在90 min 時(shí)僅為35.60%。

        圖6 樣品體外釋放曲線Fig.6 In vitro release curves for samples

        2.7 藥動(dòng)學(xué)行為研究

        2.7.1 灌胃液制備 取納米混懸劑、物理混合物凍干粉(以柚皮素計(jì)5 mg) 各228 mg,置于3 mL蒸餾水中,混勻,即得。

        2.7.2 給藥方案及血漿采集 12 只大鼠隨機(jī)分為2 組,每組6 只,給藥劑量15 mg/kg,于0、5、10、15、30、45、60、90、180、240、360 min 眼眶采血各約0.3 mL, 置于肝素化離心管中,3 500 r/min離心5 min,分取上層血漿置于另一空白離心管中,-20 ℃冰箱中保存。

        2.7.3 樣品處理[6]取血漿樣品100 μL,加入2%甲酸30 μL,渦旋3 min,繼續(xù)加入乙酸乙酯1.5 mL, 渦 旋8 min 提 取 后12 000 r/min 離 心15 min,上清液轉(zhuǎn)移至另一空白離心管中,45 ℃氮?dú)獯蹈桑?00 μL 甲醇復(fù)溶,置于進(jìn)樣瓶內(nèi)襯管中,在“2.1.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣20 μL 測定。

        2.7.4 方法學(xué)考察 配制500、400、250、100、50、20 ng/mL 對照品溶液,各取300 μL,氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00 μL 空白血漿,振蕩混勻,即得對照品溶液,在“2.1.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣20 μL 測定,以峰面積(Y) 對溶液質(zhì)量濃度(X) 進(jìn)行線性回歸,得方程為Y=0.112 7X+9.687 2(R2=0.998 6)。取20、250、500 ng/mL 對照品溶液,在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定6 次,測得柚皮素日內(nèi)精密度RSD 均小于1.92%,表明該方法精密度良好。取處理后的血漿樣品溶液,48 h 內(nèi)設(shè)置6 次進(jìn)樣點(diǎn),在“2.1.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定,測得柚皮素峰面積RSD 為1.88%,表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取500、250、50 ng/mL 血漿對照品溶液,在“2.1.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定, 測得回收率在91.38%~96.52%之間。

        2.7.5 測定結(jié)果 繪制血藥濃度-時(shí)間曲線,通過3P97 程序統(tǒng)計(jì)矩模型計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù),結(jié)果見圖7、表2。由此可知,納米混懸劑tmax較柚皮素顯著提前 (P <0.05),Cmax由 (203.81±30.41)ng/mL 提高至 (378.24±81.53) ng/mL, AUC0~t為后者的1.86 倍。

        圖7 樣品血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.7 Plasma concentration-time curves for samples

        表2 樣品主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for samples

        表2 樣品主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for samples

        注:與柚皮素比較,*P<0.05,**P<0.01

        參數(shù) 單位 柚皮素 納米混懸劑tCmmaxa x ng·m h L-1 20 13..98 61± ±03.0 3.74 1 37 18..02 84± ±08.1 1.9 53***AUC0~t ng·mL-1·h 706.57±81.54 1 318.19±143.79**AUC0~∞ ng·mL-1·h 719.34±84.17 1 406.44±150.91**

        3 討論

        在制備納米混懸劑過程中,有機(jī)溶劑與水互溶程度越高,攪拌條件下兩相混合時(shí)擴(kuò)散越快,越有利于小粒徑納米??焖傩纬?,綜合考慮溶解度、毒性等因素,選擇無水乙醇作為制備溶劑。 據(jù)報(bào)道[14],沉淀法制備納米粒是放熱過程,溫度較高時(shí)會(huì)增加納米粒子之間碰撞機(jī)會(huì),容易出現(xiàn)晶體成長和納米粒聚集,故較低的制備溫度有助于獲得粒徑、PDI 均較小的納米混懸劑,本實(shí)驗(yàn)選擇0 ℃(冰水混合物)。

        另外,制備時(shí)需加入一定量表面活性劑,通過吸附于藥物粒子表面來提供電荷排斥作用或立體位阻作用,從而防止納米粒聚集,提高穩(wěn)定性。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)對泊洛沙姆188、聚山梨酯80、聚乙烯醇等進(jìn)行了篩選,發(fā)現(xiàn)所得納米粒粒徑均較大,其原因可能是這些表面活性劑不能吸附于納米粒表面,無法提供電荷排斥作用或立體位阻作用[15]。由于表面活性劑聯(lián)合應(yīng)用可提高納米粒長期穩(wěn)定性[16],故實(shí)驗(yàn)選擇PVP K30-卵磷脂(1 ∶1),此時(shí)所制備的納米粒粒徑較小。

        體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示,柚皮素納米混懸劑相對生物利用度較原料藥提高了1.68 倍,其原因可能如下:納米??诜笠徊糠挚稍谝僚蔂柦Y(jié)(約占整個(gè)胃腸道黏膜的1/4) 中聚集,并通過淋巴結(jié)中的M 細(xì)胞最終進(jìn)入血液循環(huán)[17-18];增加了藥物與胃腸道的接觸面積,同時(shí)其黏附性使藥物在胃腸道停留時(shí)間延長,有助于充分吸收;納米混懸劑技術(shù)提高了柚皮素溶解度和溶出度,有助于溶解后的藥物順利吸收進(jìn)入血液循環(huán);處方中表面活性劑也具有促進(jìn)藥物吸收的作用。據(jù)報(bào)道[19],納米混懸劑生物利用度提高程度還受難溶性藥物基本性質(zhì)(分子量大小、脂溶性、熔點(diǎn)、晶型、分子極性表面積等)、納米混懸劑本身理化性質(zhì)(穩(wěn)定性、溶解度、粒徑分布等)、機(jī)體生理特性等因素影響,故將不同難溶性藥物制成納米混懸劑后,其生物利用度提高程度存在較大差別,值得研究人員關(guān)注。

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