廖彭瑩, 李典鵬, 扈芷怡, 陳慧萍, 楊小妹, 吳勇燕
(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧530001;2.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所,廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 桂林541006)
楊桃根為酢漿草科五斂子屬植物楊桃Averrhoa carambola L.的根或根皮,其味酸、澀,性平,具有祛風(fēng)除濕、行氣止痛、澀精止帶的功效[1],含有類(lèi)型豐富的活性成分[2-6],其中多糖具有降血糖、抗氧化作用[5-7]。
糖尿病是以持續(xù)高血糖為主要生化特征的綜合代謝性疾病,發(fā)病率持續(xù)增加,目前我國(guó)患病人數(shù)已居世界第一[8]。α-葡萄糖苷酶是食物中碳水化合物水解的關(guān)鍵酶,相關(guān)抑制劑通過(guò)抑制其活性來(lái)阻滯多糖、雙糖水解,延緩葡萄糖吸收,從而使血糖平穩(wěn)緩慢地維持在一定水平[9],部分植物多糖已證實(shí)具有較強(qiáng)抑制活性[10-12],但楊桃根多糖相關(guān)研究尚無(wú)報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)將優(yōu)化楊根多糖提取工藝,并評(píng)價(jià)其體外活性,以期為該成分開(kāi)發(fā)利用提供參考。
1.1 儀器 RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠); 酶標(biāo)儀 (美國(guó)伯騰儀器有限公司);BSA224S 電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);恒溫水浴器(金壇市醫(yī)療儀器廠);PH 計(jì)(德國(guó)賽多利斯公司); 微量移液器 (德國(guó)Eppendorf 公司)。
1.2 藥材 楊桃根于2015 年6 月采于廣西南寧,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)朱意麟實(shí)驗(yàn)師鑒定為酢漿草科五斂子屬植物楊桃Averrhoa carambola L.的根,粉碎過(guò)40 目篩后備用。
1.3 試劑 維生素C 購(gòu)自天津博迪化工股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (DPPH)、2,2-聯(lián) 氮-二 (3-乙 基-苯 并 噻 唑-6-磺 酸) 二 銨 鹽(ABTS) 購(gòu)自上海伊卡生物技術(shù)有限公司;過(guò)硫酸鉀購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?;瘜W(xué)試劑公司;α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;D-(+) -葡萄糖購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純。
2.1 藥材預(yù)處理 稱(chēng)取藥材粉末600 g, 加入3 000 mL 石油醚回流提取3 次,每次1 h,藥渣揮干,加入95%乙醇3 000 mL 回流提取3 次,每次1 h,藥渣揮干,得到藥渣555 g。
2.2 多糖含有量測(cè)定
2.2.1 線性關(guān)系考察 精密吸取不同體積葡萄糖對(duì)照品溶液(0.10 mg/mL) 于50 mL 量瓶中,蒸餾水定容,搖勻,精密吸取2 mL 于10 mL 具塞試管中,加入苯酚1 mL、濃硫酸8 mL,搖勻,冷卻,靜置30 min;另取2 mL 蒸餾水同法操作,作為空白參比,在485 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)(A),溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X) 進(jìn)行回歸, 得方程為A =10.045X +0.054 06 (r =0.999 1),在0.010 ~0.060 mg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
2.2.2 方法學(xué)考察
2.2.2.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.05 mg/mL 多糖溶液6 份,每份1.5 mL,置于10 mL 具塞試管中,按“2.2.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度,測(cè)得其RSD 為0.40%,表明儀器精密度良好。
2.2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取0.05 mg/mL 多糖溶液1.5 mL, 置于10 mL 具塞試管中, 按“2.2.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度,每隔30 min 1 次,測(cè)得其RSD 為0.64%,表明溶液在3 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取藥材5 份,每份1 g,按“2.1” 項(xiàng)下方法預(yù)處理后將藥渣揮干,加入50 mL 蒸餾水煎煮2 次,每次1 h,過(guò)濾得到水提液,定容至100 mL 量瓶中,精密量取1.5 mL 于10 mL 具塞試管中,按“2.2.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度,測(cè)得其RSD 為1.57%,表明該方法重復(fù)性良好。
2.2.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取5 份0.05 mg/mL多糖溶液,每份5 mL,加入0.1 mg/mL對(duì)照品溶液1.5 mL,定容至10 mL,按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度,測(cè)得其平均加樣回收率為98.10%,RSD 為5.51%。
2.3 單因素試驗(yàn)
2.3.1 提取時(shí)間 精密稱(chēng)取適量藥渣(M1),置于250 mL 具塞錐形瓶中,加入料液比1 ∶30 的蒸餾水,超聲(40 kHz、200 W) 處理20、30、40、50、60 min,每組平行3 次。所得提取液過(guò)濾,濾液減壓濃縮至約10 ~15 mL,加入4 倍量無(wú)水乙醇至含醇量為80%,靜置過(guò)夜,抽濾,沉淀用無(wú)水乙醇、乙醚、丙酮各5 ~10 mL 洗滌,減壓干燥,得到多糖,精密稱(chēng)定質(zhì)量(M2),計(jì)算提取率,公式為提取率=M2/M1×100%,結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可知,隨著提取時(shí)間延長(zhǎng),多糖提取率逐漸上升,在50 min 時(shí)最高,為1.85%,但繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)反而明顯下降,故選擇30~50 min 作進(jìn)一步優(yōu)化。
圖1 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides
2.3.2 提取溫度 精密稱(chēng)取適量藥渣于250 mL 具塞錐形瓶中,加入料液比1 ∶30 的蒸餾水,提取溫度50、60、70、80、90 ℃,超聲處理30 min,每組平行3 次,提取液過(guò)濾,按“2.4.1” 項(xiàng)下方法計(jì)算多糖提取率,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可知,隨著提取溫度升高,多糖提取率緩慢增加,在60 ~70 ℃之間最高,但繼續(xù)升高時(shí)反而明顯下降,故選擇50~70 ℃作進(jìn)一步優(yōu)化。
圖2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides
2.3.3 料液比 精密稱(chēng)取適量藥渣于250 mL 具塞錐形瓶中,加入料液比1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50 的蒸餾水,提取溫度70 ℃,超聲處理30 min, 每 組 平 行3 次, 提 取 液 過(guò) 濾, 按“2.3.1” 項(xiàng)下方法計(jì)算多糖提取率,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知,料液比1 ∶20、1 ∶40 時(shí)多糖提取率最高,但1 ∶50 時(shí)明顯下降,可能是后期處理過(guò)程中提取液過(guò)多而造成多糖損失, 故選擇料液比1 ∶20~1 ∶40 作進(jìn)一步優(yōu)化。
圖3 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides
2.4 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇提取時(shí)間 (30、 40、 50 min)、 提 取 溫 度 (50、 60、70 ℃)、料液比(1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40) 作為影響因素,多糖提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo),設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn),每組3 個(gè)平行。結(jié)果見(jiàn)表1,方差分析見(jiàn)表2。
表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.1 Design and results of tests
表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance
由表1 可知,各因素影響程度依次為提取溫度>料液比>提取時(shí)間,最優(yōu)工藝為A3B1C2,即提取溫度70 ℃,提取時(shí)間30 min,料液比1 ∶30。由表2 可知, 提取溫度、 料液比具有顯著影響(P<0.05),而提取時(shí)間無(wú)顯著影響(P>0.05)。
2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照優(yōu)化工藝進(jìn)行提取,平行3次,測(cè)得多糖提取率分別為1.92%、 1.87%、1.99%,平均1.93%,表明工藝穩(wěn)定性良好。
2.6 多糖精制及光譜分析 采用Sevag 法對(duì)多糖溶液進(jìn)行除蛋白[13],向脫蛋白多糖溶液中加入1%雙氧水進(jìn)行脫色,再向溶液中加入乙醇至含醇量為80%,4 ℃下靜置過(guò)夜,離心,沉淀用丙酮、乙醇分別洗滌,50 ℃下烘干,即得精制多糖。然后,將其配成0.1 mg/mL,紫外分光光度法在200 ~400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描,發(fā)現(xiàn)在260、280 nm 處均無(wú)明顯吸收峰,表明不含核酸和蛋白質(zhì)[14]。
2.7 多糖體外活性研究
圖4 多糖對(duì)ABTS·+清除率的影響Fig.4 Effect of polysaccharides on the scavenging rate of ABTS·+
2.7.2 清除DPPH· 取多糖溶液、0.2 mmol/L DPPH 自由基溶液各100 μL,作為樣品組;以等體積無(wú)水乙醇代替DPPH 自由基溶液,作為空白組;以等體積蒸餾水代替多糖溶液,作為對(duì)照組,每組平行3 次,混合均勻后常溫下避光反應(yīng)30 min,于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,按“2.7.1” 項(xiàng)下方法計(jì)算清除率, 結(jié)果見(jiàn)圖5。 由圖可知, 在0.2 ~2.0 mg/mL范圍內(nèi)多糖對(duì)DPPH·的清除率隨著其質(zhì)量濃度增加而不斷升高,EC50為0.33 mg/mL。
圖5 多糖對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.5 Effect of polysaccharides on the scavenging rate of DPPH·
表3 多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用Tab.3 Effect of polysaccharides on inhibiting α-glucosidase
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化楊桃根多糖提取工藝,發(fā)現(xiàn)該方法操作簡(jiǎn)便,易于推廣應(yīng)用。再對(duì)多糖進(jìn)行精制處理和體外活性研究,發(fā)現(xiàn)該成分有較強(qiáng)的體外抗氧化活性,對(duì)ABTS·+的清除能力接近維生素C,而且同等質(zhì)量濃度下對(duì)α-葡萄糖苷酶的體外抑制作用強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照藥阿卡波糖。
α-葡萄糖苷酶抑制劑類(lèi)藥物已被推薦為治療Ⅱ型糖尿病的一線用藥,目前僅有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇3 個(gè)藥物成功上市,并應(yīng)用于臨床。本實(shí)驗(yàn)對(duì)楊桃根多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性進(jìn)行評(píng)價(jià),從新角度發(fā)現(xiàn)了其醫(yī)藥價(jià)值。
致謝:感謝國(guó)家中醫(yī)藥管理局科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中(壯) 藥化學(xué)與質(zhì)量分析實(shí)驗(yàn)室、廣西高校中藥提取純化與質(zhì)量分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供實(shí)驗(yàn)儀器及場(chǎng)所。