文/王巍 胡紅霞

北京市鱘魚、鮭鱒魚創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專欄

基因編輯技術(shù)是在DNA水平，通過刪除、插入等方式對(duì)DNA特定序列進(jìn)行改造的技術(shù)。目前人們主要通過鋅指蛋白核酸酶技術(shù)（Zincfinger nuclease，ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)（transcription activator-like effector，TALENs）和CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein-9 nuclease）等技術(shù)來實(shí)現(xiàn)編輯基因的功能。隨著全基因組測序工作成本的降低，水產(chǎn)生物后基因組時(shí)代到來，基因編輯技術(shù)在水產(chǎn)生物領(lǐng)域應(yīng)用得到較快發(fā)展。迄今已在斑馬魚、青鳉等模式魚類和羅非魚、虹鱒、鯉魚、溝鯰、野鯪、半滑舌鰨和黃鱔等水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類中建立了高效的基因編輯技術(shù)。

一、基因編輯技術(shù)

ZFNs是一種人工改造的核酸內(nèi)切酶，能夠定點(diǎn)識(shí)別DNA雙鏈位置并進(jìn)行酶切的重組蛋白。它主要是由鋅指蛋白構(gòu)成的DNA識(shí)別域和非特異性核酸內(nèi)切酶FokⅠ兩部分組成，前者特異性識(shí)別核酸序列，后者隨機(jī)地切割DNA雙鏈。2008年Doyon和Meng首次分別在斑馬魚中成功實(shí)現(xiàn)ZFN介導(dǎo)的基因敲除，得到了kdrl、slc24a5和ntl基因的突變體，其中超過30%～50%的個(gè)體能將突變遺傳給子代，子代中突變型個(gè)體有7%～18%。理論上，ZFNs可以針對(duì)任何序列編輯，但其需要構(gòu)建龐大的鋅指表達(dá)文庫，操作復(fù)雜，成本昂貴因而未能得到大規(guī)模應(yīng)用。隨著第二代核酸酶技術(shù)的出現(xiàn)，ZFNs技術(shù)逐步被第二代核酸酶技術(shù)所取代。

TALEN技術(shù)是第二代人工核酶技術(shù)，基于TALE結(jié)構(gòu)域的基因打靶技術(shù)。由特異性的TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和非特異性的FokⅠ核酸內(nèi)切酶切割結(jié)構(gòu)域組成。用TALEN對(duì)斑馬魚基因進(jìn)行編輯后，攜帶基因突變的斑馬魚可以通過生殖細(xì)胞穩(wěn)定傳遞到下一代，這為TALEN技術(shù)在其他脊椎動(dòng)物的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。Yeh實(shí)驗(yàn)室和Joung實(shí)驗(yàn)室利用REAL法構(gòu)建的TALEN在斑馬魚體細(xì)胞中得到了hey2和gria3a的突變，突變效率為11%～33%。張博實(shí)驗(yàn)室利用單元組裝法構(gòu)建的TALEN對(duì)tnikb和dip2a兩個(gè)基因成功編輯，并且獲得了可以穩(wěn)定遺傳的斑馬魚突變體。相對(duì)于ZFN技術(shù)，TALEN具備比ZFN更明顯的先天優(yōu)勢，比如TALEN結(jié)合DNA的方式更便于預(yù)測和設(shè)計(jì)；TALEN的構(gòu)建更加方便、快捷，甚至能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模、高通量的組裝；TALEN的特異性比ZFN高，而毒性和脫靶效應(yīng)則比ZFN低。但是構(gòu)建周期長，成本較高，且識(shí)別位點(diǎn)受到胸腺嘧啶的制約，難以進(jìn)行多靶點(diǎn)編輯。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是多數(shù)細(xì)菌和古細(xì)菌中的一種獲得性免疫系統(tǒng)，可將外源基因片段插入基因組中作為“記憶”，以消滅再次入侵外源DNA。該系統(tǒng)全名為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)。根據(jù)Cas蛋白種類不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)分I，II，III型。目前最常用的是II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)，包含Cas9蛋白和向?qū)NA。2013年Hwang等首次在斑馬魚上實(shí)現(xiàn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)高效的基因編輯。ZFN和TALEN技術(shù)都需要合成能夠與特異DNA序列結(jié)合的蛋白模塊，操作繁瑣費(fèi)時(shí)。CRISPR/Cas技術(shù)則使用一段向?qū)NA引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶到靶點(diǎn)處就能完成基因組編輯。與ZFN和TALEN技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)設(shè)計(jì)簡單，成本低廉，構(gòu)建周期短，可以進(jìn)行多靶點(diǎn)編輯且靶向修飾效率高，基本適應(yīng)所有類型的細(xì)胞和生物體，但仍存在脫靶率不確定等問題。

二、基因編輯技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類中的應(yīng)用

水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類是優(yōu)質(zhì)蛋白的重要來源，開展養(yǎng)殖魚類基因功能研究，揭示其遺傳發(fā)育規(guī)律，發(fā)掘和利用遺傳資源培育高產(chǎn)、抗病抗逆品種，不僅具有重要的科學(xué)意義也可以有效提高水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。近十余年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，鯉魚、斑點(diǎn)叉尾鮰、半滑舌鰨、牙鲆、草魚、翹嘴紅鲌、團(tuán)頭魴、尼羅羅非魚、青鳉、大黃魚、大西洋鮭、大西洋鱈、石斑魚等多種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的基因組已被測序，還有更多的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類正在開展測序工作，為基因編輯在水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類中的應(yīng)用提供了豐富的遺傳信息資源。

利用ZFNs技術(shù)對(duì)鯰魚的促黃體激素進(jìn)行編輯，Dunham等得到的后代具19.7%的變異率，且是不育個(gè)體。胡煒研究組利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)黃鱔的foxl2和cyp19a1a基因進(jìn)行編輯，得到雜合性F0代，基因表達(dá)降低，dmrt1表達(dá)升高，性內(nèi)分泌激素雌二醇降低。胡紅霞研究組首次通過在小體鱘胚胎中同時(shí)轉(zhuǎn)入紅色和綠色熒光蛋白載體，利用TALENS和CRISPR/Cas9進(jìn)行編輯獲得具有單一熒光的后代，實(shí)現(xiàn)了基因編輯技術(shù)在多倍體鱘魚中的應(yīng)用。同時(shí)還對(duì)小體鱘的ntl基因進(jìn)行編輯，在F0代就得到了尾部彎曲的個(gè)體。陳松林等編輯半滑舌鰨dmrt1基因，得到具有類雌性性腺的雄性，而且還出現(xiàn)兼性個(gè)體，證明dmrt1是半滑舌鰨雄性性別決定的關(guān)鍵基因。通過對(duì)性別控制相關(guān)基因的編輯，可以得到性逆轉(zhuǎn)后代。王德壽研究組通過TALENs編輯了尼羅羅非魚的dmrt1、foxl2和cyp19a1a基因，能得到性逆轉(zhuǎn)的雌魚或雄魚后代，極大的縮短了全雄育種時(shí)間。利用CRISPR/Cas9技術(shù)，Wargelius等在F0代就得到了淺色的大西洋鮭品種。利用CRISPR/Cas9對(duì)mstnba基因編輯，王晗研究組發(fā)現(xiàn)三月齡內(nèi)的鯉魚體長和體重都顯著增加。

三、基因編輯技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類研究中存在的問題及應(yīng)用展望

基因編輯技術(shù)不僅在斑馬魚、青鳉等模式魚類中展開深入研究，而且可以廣泛地應(yīng)用到經(jīng)濟(jì)魚類中，例如防止品種退化、生長速度下降、抗性降低、繁殖力降低等不良現(xiàn)象。新型基因編輯技術(shù)不僅可以敲除基因，揭示基因功能和內(nèi)在機(jī)理，還可以高效、定向地編輯目的基因，顯著地縮短了育種時(shí)間，較之傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)更加安全。

從目前的報(bào)道來看，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas系統(tǒng)基因編輯方法均存在脫靶問題，會(huì)引起基因組的重排或無法預(yù)測的突變。如何降低脫靶率和增強(qiáng)特異性成為改良基因編輯技術(shù)的主要問題。基因編輯技術(shù)是針對(duì)基因組DNA，主要通過顯微注射等方法對(duì)細(xì)胞系或胚胎進(jìn)行操作，而水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類細(xì)胞系較少，一定程度上限制了基因編輯技術(shù)的推廣應(yīng)用。多數(shù)魚類是卵生，進(jìn)行顯微注射技術(shù)和去卵膜操作時(shí)難度大，成功率低，成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類基因編輯技術(shù)應(yīng)用的主要因素。對(duì)于卵胎生魚類，目前在操作上尚沒有可以適用的基因編輯技術(shù)可以應(yīng)用。

盡管目前基因編輯技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類中還存在一定程度的技術(shù)難度，沒有廣泛應(yīng)用，但是隨著魚類基因組信息和遺傳資源的不斷挖掘，有望利用基因編輯技術(shù)更加快速有效的獲得高產(chǎn)、單性及抗病抗逆等優(yōu)良性狀新品種，甚至在魚類構(gòu)建疾病模型、進(jìn)行藥物篩選和環(huán)境監(jiān)測等方面發(fā)揮作用。