孫凱 魏戌* 朱立國(guó)* 戴建業(yè) 章軼立 謝雁鳴

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102 2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730020 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029 4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700

西醫(yī)辨病和中醫(yī)辨證相結(jié)合的現(xiàn)代病證結(jié)合模式，是當(dāng)前中醫(yī)藥及中西醫(yī)結(jié)合工作者開展臨床與科研實(shí)踐的重要模式之一[1]。動(dòng)物模型是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究過程中的重要載體，以中醫(yī)基礎(chǔ)理論和病證結(jié)合理論為指導(dǎo)，構(gòu)建出既符合西醫(yī)疾病特征又具備中醫(yī)證候特點(diǎn)的規(guī)范化病證結(jié)合動(dòng)物模型，是開展中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的重要內(nèi)容之一[2-3]。

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身骨骼代謝性疾病，已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人們健康的常見慢性疾病之一[4-6]。在我國(guó)，有學(xué)者研究表明以-2SD為診斷標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測(cè)40歲以上人群OP發(fā)病率為19.74%，約有1.12億患病人群[7]。OP覆蓋人群廣泛且嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，所需的醫(yī)療費(fèi)用給社會(huì)造成了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。中醫(yī)藥是我國(guó)獨(dú)特的醫(yī)療衛(wèi)生資源，在OP防治方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。近年來，兼具西醫(yī)疾病特點(diǎn)和中醫(yī)證候特征的OP病證結(jié)合動(dòng)物模型相繼構(gòu)建成功，并應(yīng)用于中醫(yī)藥干預(yù)OP等多方面的研究，為揭示中醫(yī)藥療效及深入了解OP相關(guān)機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)。本文旨在對(duì)目前常用的OP動(dòng)物模型和病證結(jié)合動(dòng)物模型的構(gòu)建及評(píng)價(jià)方法進(jìn)行總結(jié)，以期為OP的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型

OP發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，骨代謝疾病一直是骨科等相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。經(jīng)過長(zhǎng)期的實(shí)踐探索，OP動(dòng)物模型構(gòu)建類型紛繁多樣(見表1)，如：手術(shù)誘導(dǎo)型[8-13](去勢(shì)摘除雙側(cè)卵巢/睪丸[8])、藥物誘導(dǎo)型[14-18](腎上腺皮質(zhì)激素等藥物[14-15])、失用誘導(dǎo)型[19-20]、飲食誘導(dǎo)型[21-22](低鈣飲食[22])、基因敲除型[23-24](RANKL等基因[23])、自然退變型[25-26]等。造模動(dòng)物的選擇也具有多樣性，常用的有SD或Wistar大鼠、小鼠，兔、羊、豬、犬和獼猴等動(dòng)物較少應(yīng)用。造模的時(shí)間一般集中在2個(gè)月左右。OP模型因研究?jī)?nèi)容不同而各具特點(diǎn)，如谷氨酸單鈉藥物誘導(dǎo)的模型適用于腦源性骨質(zhì)疏松研究[16]，SAMP6小鼠更適用于老年性O(shè)P研究[25-26]。但不論如何，理想的OP模型至少需要符合以下兩點(diǎn)：一是簡(jiǎn)便，構(gòu)建模型的方法簡(jiǎn)單，可控性和可操作性強(qiáng)，造模周期較短，能較好的模擬OP發(fā)生和發(fā)展的過程；二是驗(yàn)廉，動(dòng)物模型應(yīng)與人體條件具有一致性，能最大程度反映人體的機(jī)能狀態(tài)，且模型驗(yàn)證具有較強(qiáng)的可重復(fù)性，造模費(fèi)用適中等。伴隨OP模型的構(gòu)建成功，其評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)也不斷發(fā)展完善，主要包括骨密度測(cè)定、病理學(xué)骨組織形態(tài)觀察、生化指標(biāo)檢測(cè)分析、骨生物力學(xué)指標(biāo)測(cè)試等[27-31](見表2)，多手段綜合評(píng)估方法在OP動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方面凸顯出關(guān)鍵作用。

2 骨質(zhì)疏松癥病證結(jié)合模型構(gòu)建

中醫(yī)古籍中雖沒有“骨質(zhì)疏松癥”的病名，但根據(jù)其病因病機(jī)及臨床表現(xiàn)，可將本病歸為“骨枯”、“骨痹”、“骨痿”等范疇。OP的發(fā)生發(fā)展是多臟腑共同作用導(dǎo)致的，其中腎虧為主要病因，肝虛乃關(guān)鍵因素，脾虛是重要病因[32]。腎主骨而生髓，為全身各臟陰陽之根本，若腎精虧乏則骨髓生化無源，全身結(jié)構(gòu)功能受到影響，臟腑功能衰退而致骨痿，故腎虛精虧是主要病因；肝主身之筋膜，《證治準(zhǔn)繩》中記載：“肝虛無以養(yǎng)筋，故機(jī)關(guān)不利?！惫矢窝摱荒苠︷B(yǎng)筋膜，肝氣衰則筋不能動(dòng)，導(dǎo)致活動(dòng)受限，故肝虛乃關(guān)鍵因素；脾乃后天之本，其在體合肉主四肢，脾胃虛弱則氣血生化不足，先天之精無以資養(yǎng)后天之精血，日久遂致髓少骨松，故脾虛是重要病因[33]。腎、肝、脾三臟相互聯(lián)系、相互影響，共同參與OP的生理病理全過程。中醫(yī)藥在骨質(zhì)疏松的防治方面療效確切，臨床上多采用補(bǔ)益肝腎、補(bǔ)脾益腎等治法厘定處方進(jìn)行治療，笪巍偉等[34]研究表明通過補(bǔ)“先天”和養(yǎng)“后天”的方法及基于此理論指導(dǎo)下的健脾補(bǔ)腎方[35]均可以促進(jìn)骨質(zhì)疏松性模型小鼠骨折的愈合，其他的經(jīng)典名方如左歸丸[36]、右歸丸[37]等方劑同樣作用明顯，但具體相關(guān)作用機(jī)制卻尚未明確[38]。動(dòng)物模型已經(jīng)成為開展醫(yī)學(xué)相關(guān)研究的必備手段，盡管目前已經(jīng)建立了諸多用于OP研究的動(dòng)物模型，但根據(jù)傳統(tǒng)理論指導(dǎo)的具有中醫(yī)特色的病證結(jié)合研究模型甚少，成為制約中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)學(xué)工作者開展OP研究的因素之一。

表2 骨質(zhì)疏松癥常用動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方法Table 2 Common animal model evaluation method for osteoporosis

目前，OP病證結(jié)合動(dòng)物模型主要有三種(見表3)：①腎陽虛證[39]：陳劍磨等[40]將去勢(shì)小鼠(摘除卵巢)骨質(zhì)疏松模型與氫化可的松誘導(dǎo)的腎陽虛模型結(jié)合起來構(gòu)建OP腎陽虛病證結(jié)合模型，并通過觀察造模小鼠的癥狀體征、檢測(cè)促腎上腺皮質(zhì)激素等生化指標(biāo)、骨密度檢測(cè)、骨形態(tài)組織病理觀察等方法對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。與對(duì)照組相比，病證結(jié)合模型組小鼠出現(xiàn)腎陽虛癥狀，且促腎上腺皮質(zhì)激素、促甲狀腺激素的水平降低，股骨及腰椎的骨密度下降，病理學(xué)觀察骨小梁排列稀疏且較細(xì)，破骨細(xì)胞數(shù)目增多等。因此，其得出結(jié)論認(rèn)為造模成功，且方法是穩(wěn)定可靠的；②腎陰虛證：夏炳江等[41-42]在去勢(shì)小鼠OP模型的基礎(chǔ)上灌服甲狀腺片混懸液構(gòu)建復(fù)合的腎陰虛模型，或者通過單獨(dú)臀肌注射地塞米松磷酸鈉構(gòu)建OP腎陰虛模型，其表明這兩種造模方法均能夠使造模后小鼠具有腎陰虛和OP的癥狀和體征，與對(duì)照組相比，病證結(jié)合模型組體重增加緩慢，雌二醇水平降低，環(huán)磷酸腺昔/環(huán)磷酸鳥昔的比值升高，骨密度檢測(cè)也明顯發(fā)生改變，結(jié)果表明該模型是可行的，且其造模干擾因素較少，可操作性和可控性較強(qiáng)；③脾腎兩虛證：劉梅潔等[43]通過去勢(shì)和中藥大黃灌胃兩種方法結(jié)合構(gòu)建脾腎兩虛復(fù)合型OP模型，動(dòng)態(tài)觀察大鼠的行為方式，并采用檢測(cè)大鼠骨量、骨吸收等指標(biāo)對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明脾腎兩虛模型組大鼠出現(xiàn)與臨床較吻合的脾虛證證候特征，與假手術(shù)組相比，其骨小梁體積百分比顯著降低，骨小梁吸收表面和形成表面百分比、骨小梁和骨皮質(zhì)礦化率均顯著增高，該模型能較大程度的符合臨床的發(fā)病特點(diǎn)，具有可行性。

3 存在的問題及展望

采用病證結(jié)合動(dòng)物模型研究疾病發(fā)生機(jī)制與干預(yù)措施作用機(jī)制已成為中醫(yī)藥研究的重要內(nèi)容，是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中不可或缺的部分。OP病證結(jié)合動(dòng)物模型在疾病造模的基礎(chǔ)上取得了一定的成績(jī)，但不可否認(rèn)，其模型構(gòu)建還存在一些問題與爭(zhēng)議，暴露出一系列亟待需要解決和引起重視的問題。第一是造模思路，目前OP病證結(jié)合模型的造模方法僅停留在疾病模型的基礎(chǔ)上加載中醫(yī)病因，從而模擬形成相應(yīng)的中醫(yī)證候以構(gòu)建模型，簡(jiǎn)單的復(fù)合造模方法與臨床實(shí)際病證結(jié)合的理念尚存在偏差。中醫(yī)辨證是建立在四診合參基礎(chǔ)上，通過望聞問切識(shí)別，而在動(dòng)物造模過程中無法全面提取四診資料，只能通過簡(jiǎn)單觀察或根據(jù)儀器進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，因此，無法客觀對(duì)臨床證型進(jìn)行復(fù)制，證型的確定在一定程度上具有主觀選擇性。同時(shí)，在造模過程中干擾因素眾多，容易影響模型的穩(wěn)定性和可靠性；第二是模型評(píng)價(jià)，OP病證結(jié)合動(dòng)物模型評(píng)判尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，造模目前主要采用骨密度測(cè)量、生物力學(xué)指標(biāo)觀察、血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)等手段，缺乏具有中醫(yī)藥自身特色的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)體系和觀察指標(biāo)，因此，國(guó)內(nèi)外對(duì)病證結(jié)合模型的認(rèn)可度一直存疑；第三，OP病證結(jié)合模型報(bào)道相對(duì)較少，目前應(yīng)用較多的僅有三種模型。然而，OP為本虛標(biāo)實(shí)疾病，瘀血致病理論在OP當(dāng)中同樣具有重要意義，但尚未見到血瘀證或者腎虛血瘀證病證結(jié)合模型的報(bào)道。在未來研究中，筆者認(rèn)為OP病證結(jié)合模型的構(gòu)建可以借鑒其他疾病病證結(jié)合模型構(gòu)建的方法，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。如今高通量測(cè)序及各種組學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，OP病證結(jié)合模型的研究可以借助這些先進(jìn)的技術(shù)手段進(jìn)行系統(tǒng)研究，尋找出中醫(yī)證候與OP之間的生物學(xué)關(guān)系，從宏觀與微觀、整體與局部相結(jié)合的角度，更深入闡明中醫(yī)藥治療OP的作用機(jī)制。

表3 骨質(zhì)疏松癥常用病證結(jié)合模型總結(jié) Table 3 Summary of the syndrome combination model commonly used in osteoporosis

總之，OP病證結(jié)合動(dòng)物模型尚處于探索階段，距離構(gòu)建客觀、全面、穩(wěn)定的動(dòng)物模型仍存在較大差距。因此，必須秉承動(dòng)物模型研究真實(shí)性、穩(wěn)定性、可行性、經(jīng)濟(jì)性等原則，繼續(xù)優(yōu)化模型的構(gòu)建方法，完善模型的評(píng)價(jià)體系，加大模型的研發(fā)力度，利用學(xué)科交叉進(jìn)行創(chuàng)新，把握好中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的歷史機(jī)遇，構(gòu)建出更加貼近臨床實(shí)際的國(guó)際公認(rèn)的OP病證結(jié)合模型。