楊駿杰 趙永見(jiàn) 王強(qiáng) 張巖 李晨光 施杞 王擁軍,4 舒冰 趙東峰*

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海 200032 3.教育部筋骨理論與治法重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032 4.上海中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，上海 201210

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(POP)是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥最常見(jiàn)的類型，患者以骨量降低、骨組織結(jié)構(gòu)損壞、骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病[1]。隨著人口老齡化日趨嚴(yán)重，POP發(fā)病率呈明顯的上升趨勢(shì)，給患者、家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[2]。雌激素缺乏導(dǎo)致骨吸收增強(qiáng)是POP的重要病理改變，因此，降低骨吸收和增加骨生成，恢復(fù)骨吸收和骨生成的平衡成為治療POP的重要策略。目前臨床針對(duì)POP的治療方案主要體現(xiàn)兩個(gè)方面：①通過(guò)刺激成骨細(xì)胞分化促進(jìn)骨生成。②通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的骨吸收[3]。但是，目前臨床上現(xiàn)存治療POP的藥物效果存在諸多不足[4]。因此，尋找安全有效、便于長(zhǎng)期服用的藥物是醫(yī)務(wù)工作者面臨的重要挑戰(zhàn)。

中醫(yī)藥多遵從“腎主骨”理論指導(dǎo)治療POP，補(bǔ)腎益精法是臨床治療POP重要法則之一，骨疏康顆粒(GSK)是其中具有代表性的方劑。GSK是在中醫(yī)“補(bǔ)腎、益氣、壯骨”等理論指導(dǎo)下構(gòu)建的方劑，前期臨床效果顯著，成為中醫(yī)藥治療POP的代表方劑。隨后研究表明GSK能夠抑制骨量丟失[5]，發(fā)揮系統(tǒng)調(diào)控骨生成和骨吸收的骨保護(hù)作用。同時(shí)，GSK能夠顯著提高血液中維生素D和鈣的代謝水平[6]，從而增強(qiáng)骨生成。但是GSK在血液中對(duì)骨代謝指標(biāo)的明確藥理學(xué)作用尚未闡述。本研究以O(shè)VX小鼠為研究對(duì)象，闡述GSK治療POP的藥理學(xué)代謝作用。

1 材料和方法

1.1 材料準(zhǔn)備

骨疏康顆粒(GSK)，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：Z20003255，遼寧康辰藥業(yè)有限公司，主要成分：淫羊藿、熟地黃、骨碎補(bǔ)(補(bǔ)腎藥物)、黃芪(益氣)、丹參(活血)、木耳、黃瓜子等，遵循中藥補(bǔ)腎、益氣、活血等原理組方而成。按Meeh-Rubner氏公式[7]計(jì)算人體表面積為1.8 m2，小鼠體表面積為0.0 067 m2。按人的劑量為20 g骨疏康顆粒/70(kg·d)計(jì)算，小鼠的等效劑量約為4 g/(kg·d)。GSK溶于生理鹽水，按照每次0.5 mL每只的劑量灌胃，每天一次連續(xù)干預(yù)3個(gè)月。

鈣爾奇作為陽(yáng)性對(duì)照藥使用。鈣爾奇D碳酸鈣D3片(600 mg+D3 125IU，片劑)，國(guó)藥準(zhǔn)字H10950029，惠氏制藥有限公司。本實(shí)驗(yàn)中按照臨床劑量進(jìn)行轉(zhuǎn)換，鈣爾奇D600。按人的劑量為2片/70(kg·d)計(jì)算，小鼠的等效劑量為0.372片/(kg·d)。每只小鼠平均體重30 g。將每片鈣爾奇D溶于44.8 mL生理鹽水，濃度0.2 232 g/mL，每只每次按0.5 mL劑量灌胃，每天一次連續(xù)干預(yù)3個(gè)月。

1.2 動(dòng)物造模和干預(yù)

3月齡雌性C57BL/6小鼠120只，來(lái)自SLAC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。隨機(jī)分組(20只/組)為：正常組(假手術(shù)組，Con)、模型組(OVX)、鈣爾奇對(duì)照阻(CA)、GSK低劑量組[GSKL：2 g/(kg·d)]、GSK中劑量組[GSKM：4 g/(kg·d)]和GSK高劑量組[GSKH：8 g/(kg·d)]。動(dòng)物造模時(shí)，采用氯胺酮麻醉，從背部施行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，假手術(shù)組僅從背部暴露腹腔，將卵巢暴露，剪去適量脂肪后復(fù)位縫合。保溫條件下確保每組至少有16只小鼠存活。術(shù)后給予不同劑量GSK灌胃3個(gè)月。其中，鈣爾奇對(duì)照組[0.223 g/(kg·d)]，正常組和模型組給予等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采集標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)分析。上述實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用機(jī)構(gòu)委員會(huì)批準(zhǔn)(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：SZY201603007)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1小鼠體重變化情況：小鼠體重能夠從整體水平反映小鼠的健康狀態(tài)，也是評(píng)價(jià)藥物治療POP療效和安全性的常用數(shù)據(jù)之一，本研究分別在治療期間的1、2和3個(gè)月稱量各組小鼠的體重變化情況。

1.3.2血清骨代謝指標(biāo)：小鼠采用眼球取血方法獲得全血，離心后獲得血清。血清濃縮后按照等比例進(jìn)行稀釋。從SUSABIO 生物公司購(gòu)買(mǎi)的ELSA 試劑盒，分別檢測(cè)小鼠血清中β-CTX、PINP、ALP、OCN表達(dá)水平。按試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作步驟，加入血清后37 ℃震蕩30 min，然后酶標(biāo)儀于562 nm檢測(cè)各組小鼠血清中β-CTX、PINP、ALP和OCN的表達(dá)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3骨組織形態(tài)學(xué)：小鼠處死后取L5椎體，放入10%福爾馬林過(guò)夜，然后流水沖洗2 h，加入4% EDTA脫鈣液進(jìn)行脫鈣3周。然后用石蠟包埋和切片(5 μm)。樣本切片后，常規(guī)脫蠟至水，鹽酸乙醇分化30 s，之后放入Amresco公司的阿爾新藍(lán)染色劑(貨號(hào)0298)30 min，再次鹽酸乙醇分化5 s后放入Acridine Orange 染色液中15 min，然后封片固定和干燥。分別觀察正常組(Con)、模型組(OVX)、鈣爾奇組(CA)以及GSK的低(GSKL)、中(GSKM)、高(GSKM)3個(gè)劑量組小鼠腰椎的骨組織形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果滿足正態(tài)分布、方差性檢驗(yàn)，組間比較使用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，用Dunnett檢驗(yàn)比較GSK各劑量組、CA組與OVX組差異。上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果，P< 0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSK對(duì)小鼠體重的影響

實(shí)驗(yàn)各組分別在小鼠造模成功后1周內(nèi)開(kāi)始灌胃小鼠(0 m)，并測(cè)量小鼠的體重。為檢測(cè)GSK對(duì)小鼠體重影響，我們分別在干預(yù)1、2、3個(gè)月內(nèi)，稱量各組小鼠的體重變化。結(jié)果顯示OVX組小鼠體重出現(xiàn)的增加(P<0.05),這與前面研究的發(fā)現(xiàn)吻合，其原因可能是去除卵巢后導(dǎo)致小鼠基礎(chǔ)代謝率下降，因此對(duì)小鼠體重有刺激作用[8]。同時(shí)，在GSK干預(yù)的1、2和3月內(nèi)，GSK干預(yù)各組小鼠之間的體重與OVX組體重有所下降，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示只有中劑量組(GSKM)觀察到統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，低劑量組和高劑量組未觀察到統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。

表1 GSK對(duì)小鼠體重的影響Table 1 Effect of GSK granule on the body weight of mice

注：0 m 造模成功后1周內(nèi)的體重；1 m GSK灌胃1個(gè)月各組小鼠體重的變化；2 m GSK灌胃2個(gè)月各組小鼠體重的變化；3 m GSK灌胃3個(gè)月各組小鼠體重的變化。與正常組比較，*P< 0.05，與模型組比較，#P< 0.05。

2.2 血清骨代謝指標(biāo)

采集外周血液后，檢測(cè)各組小鼠血清中β-CTX、PINP、ALP、OCN等骨生成指標(biāo)的表達(dá)水平(圖1)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)OVX組3月時(shí)小鼠血清中骨生成指標(biāo)與對(duì)照組相比，ALP(圖2 A)和OCN(圖2B)的表達(dá)有顯著升高(P< 0.05)，而PINP(圖2C)的表達(dá)下降(P< 0.05)。GSK干預(yù)后，骨生成指標(biāo)PINP下降趨勢(shì)減緩，而ALP和OCN的表達(dá)繼續(xù)維持在較高水平。骨吸收指標(biāo)方面，OVX組3月時(shí)骨吸收的β-CTX(圖2D)指標(biāo)升高(P< 0.05)，GSK干預(yù)后，β-CTX表達(dá)下降。血清學(xué)的研究表明GSK干預(yù)能夠在總體水平上刺激骨生成相關(guān)指標(biāo)PINP、ALP、OCN的表達(dá)，同時(shí)降低骨吸收指標(biāo)β-CTX的表達(dá)，從而發(fā)揮系統(tǒng)調(diào)控骨生成和骨吸收的作用。

圖1 GSK對(duì)小鼠血清中骨代謝ALP、OCN、PINP和β-CTX的影響(A)GSK刺激小鼠血清中ALP的表達(dá)。(B)GSK刺激小鼠血清中OCN的表達(dá)。(C)GSK刺激小鼠血清中PINP的表達(dá)。(D) GSK降低小鼠血清中β-CTX的表達(dá)。與正常組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05。Fig.1 Effect of GSK granule on the serum expression of bone metabolic parameters ALP, OCN, PINP, and β-CTX

2.3 骨組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

小鼠腰椎取材后，采用阿爾新藍(lán)染色觀察GSK對(duì)小鼠骨結(jié)構(gòu)的作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去卵巢3月后，小鼠出現(xiàn)骨量丟失的表型，具體體現(xiàn)在小鼠腰椎的骨小梁數(shù)目較少、結(jié)構(gòu)疏松、間隙變大(圖2)。GSK干預(yù)后，小鼠骨量丟失得到緩解。上述研究表明，GSK干預(yù)后OVX小鼠骨量丟失的表型得到緩解，從而發(fā)揮了延緩去卵巢誘導(dǎo)的骨丟失的療效。

圖2 GSK對(duì)小鼠腰椎骨結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Effect of GSK granule on bone structure in the lumber vertebrae

3 討論

本研究通過(guò)測(cè)量動(dòng)物體重、血清骨代謝指標(biāo)和組織形態(tài)等手段，證明GSK干預(yù)OVX小鼠模型骨量丟失的保護(hù)作用。同時(shí)在血液代謝水平能夠降低骨吸收過(guò)程中β-CTX 的表達(dá)，同時(shí)刺激骨生成相關(guān)指標(biāo)PINP、ALP、OCN的表達(dá)。并在組織學(xué)加以驗(yàn)證。綜上所述，本研究提示GSK的兩方面作用：一方面，能刺激成骨細(xì)胞的骨生成，提高PINP、ALP、OCN的表達(dá)水平。另一方面，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收，降低β-CTX的表達(dá)。因此，本研究部分闡述了GSK發(fā)揮治療POP的藥物學(xué)作用，也為后期機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

OVX模型是目前較為公認(rèn)的POP動(dòng)物模型[9]，常用于POP治療和預(yù)防的藥物開(kāi)發(fā)的藥理、藥效等實(shí)驗(yàn)。早在20世紀(jì)40年代Albright就提出POP的病理改變[10]：發(fā)現(xiàn)雌激素水平下降與POP的發(fā)病有密切的相關(guān)性。隨后，研究發(fā)現(xiàn)雌激素可直接作用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的雌激素受體，限制骨代謝中的骨轉(zhuǎn)換[11]，延緩骨量丟失發(fā)揮骨保護(hù)作用。目前治療POP的方法是一方面通過(guò)刺激成骨細(xì)胞分化促進(jìn)骨生成，另外一個(gè)方面是抑制破骨細(xì)胞的骨吸收。但是目前臨床常用的藥物雖取得一定療效，但是存在諸多不良反應(yīng)。中醫(yī)藥已被證實(shí)是一種有效治療POP替代藥物，其優(yōu)勢(shì)是能夠同時(shí)增加骨生成和抑制骨吸收，從而延緩骨量丟失，改善POP患者的骨質(zhì)疏松病變[12]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，利用中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥，著重調(diào)整機(jī)體整體功能，已成為一種趨勢(shì)。

POP屬于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的病名，該病在歷代中醫(yī)文獻(xiàn)中未見(jiàn)有明確的記載，但是根據(jù)其癥狀應(yīng)該屬于中醫(yī)“腰痛”、“骨枯”、“骨燒”、“骨痿”、“虛勞”等疾病的范疇。POP發(fā)病的癥狀與“骨痿”病因、病機(jī)最為相似。其病因病機(jī)主要有腎精虧虛、脾胃虛弱、肝失調(diào)達(dá)、瘀血阻絡(luò)等[13-14]。其中腎精虧虛是最為核心的病理基礎(chǔ)，補(bǔ)腎益精法是治療POP的一個(gè)重要法則。前期研究發(fā)現(xiàn)GSK治療POP的作用原理是補(bǔ)腎益氣、活血達(dá)到壯骨的目的[15]。其組成淫羊藿、熟地黃、骨碎補(bǔ)能益精填髓、補(bǔ)益肝腎，是為君藥；黃芪、丹參益氣活血，輔助配合補(bǔ)腎藥物的補(bǔ)益作用，是臣藥；木耳、黃瓜子補(bǔ)腎益氣，活血壯骨，為佐使之藥。因此，上述諸藥配合主要治療腎虛、氣血不足所致包括POP在內(nèi)的中老年骨質(zhì)疏松癥，適用于伴有腰脊酸痛、足膝酸軟、神疲乏力等腎虛癥狀的患者。

本研究從小鼠體重檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，GSK干預(yù)的1、2、3月內(nèi)OVX小鼠體重的出現(xiàn)下降，提示GSK干預(yù)后對(duì)OVX小鼠體重有所降低，從而佐證本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的藥物劑量未造成明顯的毒性，藥物的劑量選擇是在安全劑量的范圍內(nèi)。血清骨代謝指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn) GSK干預(yù)3月內(nèi)能夠增加去卵巢血清中ALP、OCN和PINP的表達(dá)，增加成骨細(xì)胞的活性。ALP、OCN是參與成骨細(xì)胞分化的的重要調(diào)控因子，他們與PINP都是反映成骨細(xì)胞骨生成的主要指標(biāo)[16]。同時(shí)，補(bǔ)鈣是臨床治療POP的常見(jiàn)基礎(chǔ)方法，因此，本課題使用鈣爾奇(CA)作為POP的基礎(chǔ)用藥和平行對(duì)照藥物，證明GSK的療效的確切性。但是，本課題目的是明確GSK的治療效果，鈣爾奇僅作為陽(yáng)性參照，雖然鈣爾奇與OVX組相比，也能提高血清中ALP、OCN和PINP的表達(dá)，但是其僅僅是作為陽(yáng)性對(duì)照，而未涉及GSK與鈣爾奇療效的比較作用，未來(lái)研究可能涉及此作用。另外，GSK在調(diào)控破骨細(xì)胞分化方面的表現(xiàn)在能抑制OVX小鼠破骨活性指標(biāo)β-CTX的高表達(dá)，從而抑制骨吸收。β-CTX是破骨細(xì)胞骨吸收溶解Ⅰ型膠原的進(jìn)一步分解產(chǎn)物，通過(guò)檢測(cè)血清β-CTX的水平對(duì)于早期診斷POP，評(píng)估骨量減少程度具有重要意義[17]。上述血清學(xué)作用通過(guò)骨組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)得以證明：GSK的低、中、高劑量干預(yù)能夠延緩OVX造成的骨量丟失，其機(jī)制與其刺激骨生成和抑制骨吸收的作用相關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通OVX小鼠體重、血清骨代謝指標(biāo)和組織形態(tài)的研究證明GSK顆粒能刺激成骨細(xì)胞的骨生成和抑制破骨細(xì)胞的骨吸收，發(fā)揮系統(tǒng)調(diào)控的作用。該研究為后續(xù)治療POP相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)奠定了一定的研究基礎(chǔ)，同時(shí)也拓寬了臨床治療POP藥物選擇的范圍。