白新磊

1.轉(zhuǎn)基因 狹義：人為將DNA片段插入基因組 廣義：人為的對生物基因組的修飾，包括隨機的基因片段插入，基因定位敲除，基因定位敲入，基因定點突變等 。

2.轉(zhuǎn)基因動物： 指染色體基因組中整合有外源基并能穩(wěn)定遺傳給后代的一類動物。

3.嵌合體動物（Chimeric animal）：部分組織細胞中整合有外源基因組的動物。

4. 轉(zhuǎn)基因動物方法： 顯微注射法，逆轉(zhuǎn)錄病毒法，ES（胚胎干細胞）法，精子載體法

脂質(zhì)體載體法，電脈沖法，基因槍法，核移植技術(shù)（轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)）

5.常見轉(zhuǎn)基因技術(shù)

常規(guī)方法：①受精卵細胞核DNA顯微注射，隨機插入，預(yù)見性低，但多樣性

②利用精子轉(zhuǎn)染DNA，效率低，重復(fù)性差

③利用轉(zhuǎn)坐子進行DNA在基因組的插入，方法復(fù)雜，受限多

④病毒感染：效率高，隨機性低，可帶DNA大小受限制，安全隱患，常用于大動物

⑤干細胞/胚胎顯微注射：常用于小鼠基因定位修飾，預(yù)見性高，費時，大動物不成功

⑥核移植/動物克?。捍髣游锘蚨ㄎ恍揎椢ㄒ煌緩?/p>

⑦CRISPR/Cas9技術(shù)：最新發(fā)展的，快速、簡便、高效基因組修飾技術(shù)

6.轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建： 啟動子選取 cDNA選取? Poly A 選用? 內(nèi)含子和封閉區(qū)? 載體構(gòu)建

7.逆轉(zhuǎn)錄病毒法： 1、Retrovirus是只有一條單鏈RNA的病毒類的總稱。2、逆轉(zhuǎn)錄病毒在逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）的作用下可以將本身的單鏈RNA作為模板進行復(fù)制和遺傳信息的傳遞。3、逆轉(zhuǎn)錄病毒通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用而進入宿主細胞。

原理： 1、逆轉(zhuǎn)錄病毒具有高效感染和在宿主細胞DNA上高度整合的特性。

2、逆轉(zhuǎn)錄病毒能作為目的基因載體，通過感染早期胚胎細胞實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生嵌合體動物，再經(jīng)過雜交、篩選即可獲得轉(zhuǎn)基因動物。

關(guān)鍵步驟：（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建? ①提取病毒DNA②將DNA克隆載體中③酶切病毒結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)④將外源目的基因克隆到載體⑤轉(zhuǎn)染細胞，測定外源基因的表達。? （2）包裝細胞 決定著重組病毒效價及其宿主范圍。? 常用φ-2細胞株（3）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染早期胚胎? 載體轉(zhuǎn)染包裝細胞后與8細胞胚胎共培養(yǎng)進行轉(zhuǎn)染（4）胚胎移（5）建系

8.胚胎干細胞介導(dǎo)法： 1、胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）人或動物的胚胎中均存在一些具有高度更新能力和多向分化能力但尚未分化的干細胞，稱胚胎干細胞。2、它與早期胚胎聚集，或被注射到胚胎后，能參與宿主胚胎的發(fā)育，形成包括生殖細胞在內(nèi)的所有組織。

原理： 將外源目的基因?qū)隕S細胞，再移入胚泡期的宿主胚胎，最后將宿主胚胎移植到假

孕母鼠子宮內(nèi)，便可獲得由胚胎干細胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因動物。

關(guān)鍵步驟： ①ES細胞的分離培養(yǎng)②ES細胞基因操作 電穿孔、顯微注射、磷酸鈣-DNA共沉淀、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染等方法 ③獲取囊胚期胚胎④顯微操作 ES細胞注射到囊胚期胚胎內(nèi) ⑤胚胎移植

9.顯微注射法 優(yōu)點： 1、整合率相對較高2、可導(dǎo)入基因片斷較長3、外源基因整合于所有的組織細胞中的概率高 缺點： 1、整合率隨機2、有些動物原核看不清，需經(jīng)特殊處理才能有效導(dǎo)入3、需較精密儀器，費用昂貴

10.逆轉(zhuǎn)錄病毒法 優(yōu)點：1、胚胎存活率高2、病毒DNA隨機單拷貝整合3、宿主范圍廣

缺點： 1、整合率不高，整合位點是隨機的2、后代多為嵌合體動物3、外源基因易發(fā)生重排或丟失4、病毒載體容量不大5、病毒DNA序列可能會干擾外源基因的表達

11.ES細胞法 優(yōu)點： 1、整合率可控2、可用多種方法將外源基因?qū)隕S細胞，其細胞的鑒定和篩選比較方便3、ES細胞注入囊胚及囊胚移植到子宮，操作比較簡便

缺點： 1、ES細胞系培養(yǎng)、保存和維持不易2、后代多為嵌合體3、所需時間較長

12.體細胞克隆： 將體細胞核移入去核的卵母細胞中，使卵母細胞被刺激、分裂并發(fā)育成個體，使得核供體的基因得到完全復(fù)制。

體細胞克隆的主要程序與胚胎細胞克隆基本相同，其主要差別在供體細胞的選擇

血清饑餓法：在血清濃度從10℅降至0.5℅的培養(yǎng)液中培養(yǎng)5d誘導(dǎo)至靜止期然后移入去核卵母細胞，恢復(fù)體細胞的全能性。

13.轉(zhuǎn)基因關(guān)鍵技術(shù)： 外源目的基因的制備 外源目的基因的有效導(dǎo)入 受精卵（胚胎）培養(yǎng)與移植 外源目的基因表達的檢測等

14. Gene knockout（基因敲除）：是指對一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計實驗，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推測相應(yīng)基因的功能。

15.基因治療： 指將外源功能性目的基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，通過調(diào)控目的基因表達，抑制、替代或補償缺陷基因，從而恢復(fù)受累細胞、組織或器官的生理功能，達到疾病治療目的的一種方法。

16.生物反應(yīng)器：將藥用蛋白或具有特殊意義的蛋白質(zhì)基因?qū)雱游锏氖芫鸦蛟缙谂咛?，培育成轉(zhuǎn)基因動物，使之在動物體內(nèi)（如乳腺、血液等）高效表達，生產(chǎn)出天然活性蛋白，這種轉(zhuǎn)基因動物就稱之為動物生物反應(yīng)器。

17. 基因打靶：是利用同源重組技術(shù)來定點改變物種的基因組順序和結(jié)構(gòu)，從而在突變的個體內(nèi)來研究基因及基因組的功能。

18. 基因敲除：是使基因組中某個/某幾個基因或基因的順式元件產(chǎn)生缺陷，從而在突變體內(nèi)喪生正常的功能，來推測這些基因或元件原來在體內(nèi)的功能。

19. 基因敲入：在個體基因組中定點加入某個/某幾個基因或順式元件，使之表達或發(fā)揮作用，從而研究該基因或順式元件在體內(nèi)的功能。

20. 基因組編輯技術(shù)（genome editing）是一種可以在基因組水平上對DNA序列進行改造的遺傳操作技術(shù)。技術(shù)的原理是構(gòu)建一個人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過程中會產(chǎn)生突變，從而達到定點改造基因組的目的。