許 伶，凌夢(mèng)玉，陳 超，呂正梅

隨著生活方式的改變，高脂飲食、缺少運(yùn)動(dòng)等不健康生活方式引起的肥胖相關(guān)疾病發(fā)病率逐年升高。脂質(zhì)代謝紊亂是許多原發(fā)性和繼發(fā)性腎臟疾病的共同特征之一[1]。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂時(shí)，會(huì)導(dǎo)致腎臟內(nèi)的脂質(zhì)沉積，進(jìn)而進(jìn)展為腎損傷。國內(nèi)外圍繞脂質(zhì)代謝紊亂引發(fā)的慢性腎損傷的研究越來越多，但對(duì)其治病機(jī)制仍不十分明確。白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是多酚類化合物。目前已經(jīng)證實(shí)其具有抗炎、抗氧化的作用，具有保護(hù)心臟和腦缺血以及抗腫瘤作用[2]。近年來，研究[3-4]表明其還具有腎臟保護(hù)作用。目前研究顯示RSV可以通過激動(dòng)沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent information regulator factor 2 related enzyme 1，SIRT1)信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用[5]；抑制炎性因子白介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)或減少一氧化氮(nitric oxide，NO)釋放，減輕腎臟炎性狀態(tài)[6]。但RSV如何發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的機(jī)制尚不明確。該研究探索RSV減輕高脂飲食引起腎損傷的作用及機(jī)制具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模6周齡雄性C57BL/6J小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～20 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將實(shí)驗(yàn)小鼠分為3組：正常對(duì)照組(control，CTRL組)、高脂組(high lipid，HL組)、RSV干預(yù)組(RSV組)。CTRL組：普通飼料喂養(yǎng)；HL組：高脂飼料(1%膽固醇、10%豬油、10%蛋黃粉、20%蔗糖、59%維持料)喂養(yǎng)；RSV組：高脂飼料同HL組，并以RSV 5 mg/(kg·d) 灌胃，RSV購自南京澤朗植提技術(shù)有限公司，每周稱量小鼠體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整RSV用量。

1.2 血脂檢測(cè)18周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束，摘除小鼠眼球收集血液，取血清測(cè)血脂(日本OLYMPUS AU640全自動(dòng)生化分析儀)、腎功能。

1.3 腎組織學(xué)觀察各組腎組織制作5 μm厚石蠟切片，常規(guī)HE染色、PAS染色，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化。

1.4 免疫組織化學(xué)染色取各組腎組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽修復(fù)，3% H2O2孵育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶(武漢博士德生物工程有限公司)，正常山羊血清封閉；加抗纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)抗體(1 ∶200)(美國proteintech公司)，4 ℃ 孵育過夜；羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)工作液37 ℃ 孵育1 h；SP工作液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)37 ℃孵育30 min；DAB顯色(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.5 Western blot取約50 mg腎組織，加入RIPA裂解液(含PMSF，100 ∶1)充分勻漿，BCA法定量測(cè)定蛋白濃度。等量蛋白上樣后12%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)(1∶1 000)、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPx4)(1∶1 000)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)(1∶1 000)、SITR1(1∶1 000)均購自美國CST公司，GAPDH抗體(美國Proteintech公司)4 ℃ 孵育過夜，洗膜后37 ℃ 二抗(1∶10 000)孵育1 h；TBST洗膜后，現(xiàn)配顯影液，上海培清科技有限公司ECL曝光機(jī)曝光，保存圖片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Gel-ProAnalyzer軟件進(jìn)行分析。

1.6 RT-PCR取腎臟組織約50 mg，TRIzol(大連寶生生物工程有限公司)勻漿后酚-氯仿法提取總RNA。用TaKaRa公司5×PrimeScript RT Master Mix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。TaKaRa公司Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)進(jìn)行cDNA樣品擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，上海培清科技有限公司凝膠成像儀拍照，凝膠成像系統(tǒng)SensiAnsy分析處理。引物序列見表1。

表1 RT-PCR的引物序列

2 結(jié)果

2.1 3組體質(zhì)量、血脂和腎功能比較HL組與CTRL組相比，體質(zhì)量增加(P<0.05)，高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)下降，低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)增高(P<0.05)，總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)和尿酸(uric acid，UA)水平增高(P<0.05)；RSV組與HL組相比，血脂水平HDL-C升高，LDL-C下降，TC、TG和UA水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CRE)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組小鼠體質(zhì)量、血脂、腎功能比較

與CTRL組比較：*P<0.05；與HL組比較：#P<0.05

2.2 3組腎臟組織學(xué)變化HE染色顯示CTRL組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)基本正常。HL組小鼠腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)稍增多，偶見節(jié)段性腎小球硬化，腎小管間質(zhì)纖維化，可見間質(zhì)細(xì)胞增多，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；腎小管上皮細(xì)胞淡染，胞質(zhì)增多。RSV組腎小球面積略有縮小，系膜增生明顯減輕。表明RSV可以改善高脂飲食誘導(dǎo)的慢性腎臟損傷，見圖1。PAS染色顯示正常組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)基本正常，少量紅染，高脂組小鼠腎小球糖原沉積增多見明顯紅染區(qū)，RSV組腎小球紅染明顯變淡，見圖2。

圖1 各組腎臟組織病理改變 ×200A：CTRL 組；B：HL組；C：RSV組

圖2 各組腎臟組織PAS染色改變 ×400A：CTRL 組；B：HL組；C：RSV組

圖3 各組腎臟組織FN表達(dá)免疫組化染色 ×400A：CTRL組；B：HL組；C：RSV組

圖4 Western blot法檢測(cè)各組腎組織GRP78、GPx4、SOD2、SIRT1蛋白水平與CTRL組比較：*P<0.05；與HL組比較：#P<0.05

2.3 3組小鼠腎組織FN的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示FN主要在腎小體細(xì)胞間質(zhì)表達(dá)，CTRL組和RSV組小鼠腎組織呈弱陽性表達(dá)，HL組表達(dá)增加，陽性染色呈棕黃色。見圖3。

2.4 3組小鼠腎組織GRP78、GPx4、SOD2和SIRT1蛋白表達(dá)與CTRL組比較，HL組腎組織抗氧化相關(guān)蛋白GPx4、SOD2、SIRT1表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子標(biāo)志物GRP78的蛋白表達(dá)上調(diào)；與HL組比較，RSV組抗氧化相關(guān)蛋白GPx4、SOD2、SIRT1的表達(dá)上調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子標(biāo)志物GRP78蛋白的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。見圖4。

2.5 3組腎臟組織中GRP78和CHOP mRNA表達(dá)與CTRL組比較，HL組腎組織GRP78和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白的同源蛋白(CCAAT/enhancer binding protein-homologous protein，CHOP)mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；而與HL組比較，RSV組腎組織GRP78和CHOP mRNA表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P<0.05)。見圖5。

圖5 RT-PCR法檢測(cè)各組腎組織GRP78和CHOP mRNA 水平

M：Marker；與 CTRL組比較：*P<0.05；與HL組比較：#P<0.05

3 討論

肥胖對(duì)健康的影響日益嚴(yán)重，在發(fā)展中國家也變得越來越普遍。近年來，較多的研究[7]表明肥胖與腎功能障礙之間有密切的關(guān)系。目前研究[8]顯示，脂質(zhì)代謝紊亂是慢性腎臟病進(jìn)展的危險(xiǎn)因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過18周的高脂飼料喂養(yǎng)后，HL組小鼠的體質(zhì)量明顯高于CTRL組；血清中TC、TG和UA水平高于CTRL組；HL組小鼠HE染色、PAS染色和FN免疫組化結(jié)果證實(shí)，腎組織存在損傷性改變。提示高脂飲食可誘導(dǎo)小鼠的脂質(zhì)代謝紊亂，可能通過多種途徑，對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞造成損傷，引起系膜增生，細(xì)胞外基質(zhì)增厚，糖原沉積，腎小球硬化和間質(zhì)纖維化，進(jìn)而損傷其腎功能。有臨床研究[9]顯示慢性腎功能障礙和血脂異常進(jìn)展之間的密切關(guān)系。研究[10]表明，高三酰甘油血癥可促進(jìn)LDL沉積并降低HDL水平，增加慢性腎病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。

雖然脂質(zhì)介導(dǎo)的腎損傷初始機(jī)制尚不清楚，但目前認(rèn)為氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)是參與脂質(zhì)介導(dǎo)腎損傷的主要機(jī)制[11]。研究[12]表明高脂血癥能增加單核細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成速率，它是一種內(nèi)皮損傷的重要因子，隨著ROS生成增多，觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，致使內(nèi)皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重，這可能是脂質(zhì)誘導(dǎo)腎損傷的重要機(jī)制。哺乳動(dòng)物在呼吸和新陳代謝過程中產(chǎn)生的很多ROS由體內(nèi)的自由基清除劑和抗氧化酶進(jìn)行清除?？寡趸瘎㏒OD2是重要的超氧化物歧化酶；GPx4是催化氧化氫轉(zhuǎn)化為水的另外一種抗氧化物酶。SIRT1是一種NAD+依賴的蛋白去乙?；福烧{(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的代謝，誘導(dǎo)ROS的凋亡，抑制氧化應(yīng)激。研究[13]已經(jīng)證實(shí)SIRT1在腎損傷中的重要作用，無論是糖尿病腎病、急性腎損傷激活SIRT1都能夠抑制腎損傷的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)研究也表明，與CTRL組比較，HL組腎組織SIRT1、SOD2和GPx4蛋白表達(dá)明顯下調(diào)；與HL組比較，RSV組能夠上調(diào)腎組織GPx4和SOD2蛋白的表達(dá)，RSV作為SIRT1的激動(dòng)劑，則使SIRT1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。

氧化應(yīng)激雖然目前被認(rèn)為是多種疾病致病的重要環(huán)節(jié)，而任何干擾氧化還原的調(diào)控都能夠?qū)е聝?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，有研究[14]指出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可通過未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)以及與線粒體之間的相互作用產(chǎn)生過多的ROS，誘導(dǎo)局部組織和細(xì)胞的氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)。GRP78和CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR激活的標(biāo)志，CHOP是促凋亡UPR的反應(yīng)基因，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與急性腎小管壞死和急性腎損傷機(jī)制中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與CTRL組比較，HL組腎組織CHOP和GRP78 mRNA水平表達(dá)上調(diào)，以及GRP78的蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)。而與HL組比較，RSV組顯著下調(diào)腎組織CHOP和GRP78 mRNA的表達(dá)水平，下調(diào)GRP78的蛋白表達(dá)。

研究[6]顯示，RSV具有較強(qiáng)的清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化功能，可控制高熱量飲食引起的動(dòng)物體質(zhì)量增加，增強(qiáng)脂蛋白的抗氧化能力，改善血管內(nèi)皮功能，降低LDL、TC水平。因此RSV可能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂清除過多的ROS和改善與高脂相關(guān)的OS、ERS；改善腎臟上皮細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的損傷，從而發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用。

本課題闡明了長(zhǎng)期高脂飲食導(dǎo)致的腎組織損傷和腎功能下降的分子機(jī)制及RSV通過減輕腎組織氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等機(jī)制發(fā)揮保護(hù)作用機(jī)制，為慢性腎損傷治療方法提供了新的思路。