陳 康，莢衛(wèi)東，葛勇勝，陳 新

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝臟最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，占全球肝癌總數(shù)的70%～85%，是世界范圍內(nèi)第五大常見腫瘤之一，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。在過去的20年中，HCC的發(fā)病率增加了2倍，而5年生存率仍然低于12%[1]，每年大約發(fā)生782 500例新病例和745 500死亡病例，僅中國的新生病例和死亡占總數(shù)的一半左右[2]。鑒于肝細胞癌發(fā)生是通過遺傳、表觀遺傳和信號傳導程序的復雜變化而產(chǎn)生的，HCC表現(xiàn)出廣泛的異質(zhì)分子特征[3]，正是存在這種多樣性，HCC細胞具有強大的細胞存活性和增殖表型。闡明HCC起始和進展的分子機制可以改善診斷和治療策略。因此，迫切需要在該領(lǐng)域進行旨在鑒定可靠的早期診斷生物標志物和有效治療選擇的研究。

人激肽釋放酶7(kallikrein related peptidase 7，KLK7)，也曾被稱為角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶(stratum corneur chymotryptic enzyme，SCCE)，屬于激肽釋放酶相關(guān)肽酶家族,作為皮膚中最突出的蛋白酶之一，這種酶通過降解幾種不同的底物而促進脫屑和皮膚免疫系統(tǒng)活化[4]，因此它作為治療皮膚病的潛在靶點而被廣泛研究。然而在最近的報道中，KLK7在其他多種惡性腫瘤中顯示出較高的研究價值，如研究人員發(fā)現(xiàn)KLK7在宮頸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等的腫瘤組織中表達上調(diào)，而在乳腺癌和腎癌中表達下調(diào)[5]。但在肝細胞癌研究中，尚未見國內(nèi)外有相關(guān)文獻報道，該研究旨在探討KLK7在肝細胞癌中的臨床病理學意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2015年1月～2017年12月于安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院肝臟外科行根治性肝細胞癌切除術(shù)，術(shù)后經(jīng)病理確認且具備完整隨訪資料的88例石蠟切片，其中男68例，女20例；年齡20～73(52±12)歲；據(jù)Edmondson分級法標準行腫瘤分級，Ⅰ～Ⅱ級63例，Ⅲ～Ⅳ級25例；腫瘤TNM分期標準依據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)第八版標準，Ⅰ～Ⅱ期52例，Ⅲ～Ⅳ期36例。另外收集本院肝臟外科近期行根治性肝細胞癌切除術(shù)的新鮮冷凍HCC組織及其對應癌旁組織20對和TRIzol浸泡的HCC組織及其對應癌旁組織20對，行Western blot及qRT-PCR檢測。所選患者術(shù)前未行放療、化療、介入等抗腫瘤治療。

1.2 主要試劑KLK7 PAB910Hu01(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)；通用型二抗試劑盒PV-6000、DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；RIPA細胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；蘇木精BA-4041(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；TRIzol試劑(美國Life technogies公司)；qRT-PCR 引物合成(生工生物工程上海股份有限公司)；ECL超敏發(fā)光試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1Western blot 剪取肝癌及對應癌旁組織均約100 mg，加入RIPA細胞裂解液進行裂解后提取總蛋白，使用BCA法進行蛋白的定量測定，每對樣本等量蛋白上樣，電泳結(jié)束后，分離蛋白并將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把PVDF膜放置到預先準備好的Western洗滌液中，漂洗5 min，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。加入封閉液(5%脫脂奶粉)，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉2 h。KLK7-1抗體在4 ℃搖床中用兔抗1 ∶200稀釋液(10%分離凝膠)孵育過夜，之后用PBST溶液洗膜3次。二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h，PBST液洗滌3次后使用ECL超敏發(fā)光試劑盒來檢測蛋白，采用北京科創(chuàng)銳新生物凝膠成像系統(tǒng)對掃描、保存后的圖像進行灰度值分析。同法用兔抗人β-actin 作內(nèi)參對照；獲取KLK7條帶灰度值與β-actin 灰度值之比用于統(tǒng)計學分析。

1.3.2qRT-PCR 提取肝癌及癌旁組織總RNA，用于合成cDNA,隨后使用三步法進行qRT-PCR反應，設置擴增條件為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，共計40個循環(huán)，每基因樣本設置3次重復。KLK7引物正向序列：5′-CGAGCCCAGATGTGACCTTT-3′，反向序列：5′-GTCACCATTGCAGGCGTTTT-3′，擴增產(chǎn)物長度：155 bp；內(nèi)參(β-actin)引物正向序列：5′-CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3′，反向序列：5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3′，擴增產(chǎn)物長度為96 bp；KLK7 mRNA相對表達量用2-ΔΔCt進行計算。

1.3.3免疫組化 本實驗采用PicTureTM二步SP法對肝細胞癌及癌旁組織中KLK7的表達進行檢測。根據(jù)KLK7抗體的特殊要求,通過脫蠟和水合預處理組織切片。3% H2O2去離子水孵育5 min用以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS漂洗。用KLK7抗體滴注1 ∶200,在37 ℃下孵育90 min后用PBS沖洗3次,每次2 min。滴下通用IgG抗體(Fab段)-HRP聚合物,在37 ℃下孵育30 min后用PBS沖洗3次，每次2 min。蒸餾水沖洗、復染、脫水和密封。免疫組化實驗結(jié)果判定標準：首先根據(jù)切片著色細胞強度評分：顯色不清或不顯色者計為0分；淺黃色計為1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分。另外對于每張組織切片都隨機選擇5個高倍視野(400倍)，根據(jù)著色細胞所占百分比評分：0～25%細胞著色為1分；26%～50%細胞著色為2分；51%～75% 細胞著色為3分；76%～100%細胞著色為4分。切片最終分數(shù)=著色細胞所占百分比分數(shù)×著色細胞強度評分，分數(shù)≥6分定為高表達，得分<6分定為低表達。

2 結(jié)果

2.1 Western blot與qRT-PCR實驗結(jié)果通過Western blot法檢測HCC中KLK7表達情況，定量結(jié)果顯示HCC組織中KLK7相對含量(1.45±0.24)高于癌旁組織(0.65±0.16)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=28.03，P<0.001)，見圖1。qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，20對標本中KLK7在癌組織中的mRNA表達均高于對應癌旁組織，定量結(jié)果顯示KLK7在HCC組織及對應癌旁組織中的mRNA相對表達量分別為(18.39±18.18)和(9.11±13.73)，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.804，P<0.001)，見圖2。

圖1 Western blot法檢測KLK7的表達

A：KLK7蛋白在4對代表性HCC及對應癌旁組織中的表達；B：KLK7蛋白在20對HCC及對應癌旁組織中的相對表達量;與癌旁組織比較：***P<0.001

圖2 qRT-PCR法檢測KLK7 mRNA在20對肝癌及癌旁組織中相對表達量與癌旁組織比較：***P<0.001

2.2 免疫組化結(jié)果本研究通過對88例組織切片觀察結(jié)果顯示，有58例顯示KLK7在HCC細胞質(zhì)中呈高表達(65.9%)，低表達有30例(34.1%)。在對應癌旁組織中有26例呈高表達(29.5%)，低表達有62例(70.5%)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3、4。

圖3 HCC組織與癌旁組織KLK7的表達 ×100

A、C：KLK7在HCC組織中的表達；B、D:KLK7在癌旁組織中的表達

2.3 KLK7在HCC組織中的表達與臨床病理因素的關(guān)系KLK7在HCC組織中的表達上調(diào)與腫瘤直徑、腫瘤Edmondson分級、腫瘤TNM分期有關(guān)(P=0.011、0.016、0.006)；與年齡、性別、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、腫瘤包膜、肝硬化等無關(guān)(均P>0.05)，見表1。

圖4 HCC組織與癌旁組織KLK7的表達 ×400

A、C：KLK7在HCC組織中的表達；B、D:KLK7在癌旁組織中的表達

表1 KLK7的表達與患者臨床病理特征之間的關(guān)系(n)

3 討論

人激肽釋放酶基因家族由15個同源分泌的胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶組成，由染色體19q13.4區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的緊密聚簇基因編碼,人激肽釋放酶的異常表達干擾惡性腫瘤生長的不同階段，特別是在腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲中，這可能是因為其在從胚胎發(fā)育到組織重塑的生理過程中都起到重要作用，并通過協(xié)助基底膜和結(jié)締組織細胞外基質(zhì)的降解而在惡性腫瘤的擴散中發(fā)揮重要作用密切相關(guān)[6]。KLK7是一種類似胰凝乳蛋白酶的絲氨酸蛋白酶，屬于激肽釋放酶家族，最初是從皮膚中提純得到的,如其他激肽酶家族成員一樣，KLK7同樣以組織特異性方式表達，并且分別受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機制如類固醇激素(雄激素反應元件)和絲氨酸蛋白酶抑制劑的調(diào)節(jié)，因其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用而作為癌癥生物標志物被廣泛研究。

Du et al[7]在胰腺癌研究中發(fā)現(xiàn)KLK7在胰腺癌中呈現(xiàn)高表達，進一步沉默KLK7基因后誘導獲得腫瘤的抗遷移和抗侵襲能力，將其相關(guān)的分子機制解釋為KLK7對細胞外基質(zhì)蛋白和連接、黏附分子的切割導致的。蘇曉峰 等[8]也同樣證實了KLK7在胃癌中的高表達后篩選出沉默KLK7效率最高的KLK7-siRNA-416片段，瞬時轉(zhuǎn)染入胃低分化腺癌AGS細胞株，發(fā)現(xiàn)KLK7沉默后在mRNA水平及蛋白水平均勻下調(diào)。這一研究證明了胃癌細胞增殖變化的過程中有著KLK7的參與，KLK7基因的沉默影響了細胞周期的前DNA合成從而抑制細胞增殖。Xi et al[9]也通過鼠異種移植實驗檢查KLK7表達及在體內(nèi)調(diào)節(jié)食管腺癌的生長情況，證實了KLK7在食管腺癌中起致癌基因的作用，其可能的機制也與KLK7切割細胞間連接分子相關(guān)。在另外一項關(guān)于黑色素瘤的研究中，Yu et al[10]發(fā)現(xiàn)高表達水平的KLK7表達與黑素瘤患者的良好預后相關(guān)，這是少數(shù)關(guān)于高表達KLK7在腫瘤中起保護作用的報道。上述研究中，包括以往的另外一些研究[11-12]，KLK7在腫瘤中的作用機制通常被描繪為直接降解細胞外基質(zhì)的組成成分(例如纖連蛋白)促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，同時還通過降解橋粒蛋白如橋粒蛋白1和橋粒芯糖蛋白2，導致細胞黏附減少并促進腫瘤細胞侵襲，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前人們了解到細胞外蛋白水解通過主動降解和修飾細胞外基質(zhì)而促進腫瘤進展，導致惡性腫瘤的侵襲和最終轉(zhuǎn)移。幾種蛋白酶系統(tǒng)在癌癥中持續(xù)失調(diào)，并且它們負責的信號傳導直接影響腫瘤微環(huán)境[13]。這些蛋白水解級聯(lián)中的非常重要的兩個蛋白酶是基質(zhì)金屬蛋白酶和屬于絲氨酸蛋白酶的尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)及其受體(uPAR)，而這兩種蛋白酶又恰恰是被幾種激肽釋放酶激活的，這其中也包括KLK7。這種失調(diào)通常會改善癌癥進展的條件，例如通過增加細胞黏附受體來促進細胞黏附和細胞遷移，并在釋放細胞外生長因子后產(chǎn)生化學梯度。

KLK7在生理學和病理學作用已在各種組織中廣泛研究，特別是皮膚、胰腺這些廣泛受到激素調(diào)節(jié)的組織，然而其在肝臟中的生理和病理學作用仍然知之甚少，國內(nèi)外尚未見對KLK7在HCC中表達情況及其與HCC患者臨床病例特征之間關(guān)系的探討，本研究旨在檢測KLK7在HCC中的表達情況，并分析KLK7的表達與HCC患者相關(guān)臨床病理特征之間的關(guān)系。一方面本研究進行免疫組織化學實驗、qRT-PCR、Western blot實驗顯示KLK7在HCC中呈現(xiàn)高表達，另一方面本研究通過對臨床資料的分析顯示，KLK7的表達上調(diào)與腫瘤直徑、腫瘤Edmondson分級、TNM分期有關(guān)(P=0.011、0.016、0.006)，而與年齡、性別、腫瘤包膜、AFP、肝硬化等無關(guān)(P>0.05)，這表明KLK7在HCC中呈高表達可能會促進腫瘤侵襲和遷移能力，增加腫瘤的惡性程度。KLK7在HCC中作用的機制同樣可能是對HCC的細胞外基質(zhì)進行重塑，對細胞黏附分子進行降解，或者通過作為其他細胞的旁分泌因子調(diào)節(jié)機制從而改變HCC的腫瘤微環(huán)境，進而增加HCC的遷移和侵襲能力。

雖然本研究只探討了KLK7在HCC中的表達情況，分析其與臨床病理資料之間的相關(guān)性，但對其具體行為機制未作深入探究，仍然有必要進行更大樣本的進一步研究KLK7在HCC中的作用靶點及調(diào)控機制，隨著研究的深入,KLK7可能成為HCC潛在的治療靶點或分子標志物。