陳良余，毛 雨，周 揚(yáng)，費(fèi) 亮，王 健，周利民，范濤濤，沈 兵

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(big-conductance Ca2+-activated K+channel，BKCa)是電壓門控的鉀離子通道超家族成員之一，表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞、分泌細(xì)胞以及平滑肌等細(xì)胞[1]，是調(diào)節(jié)鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的重要反饋機(jī)制[2-5]。

已知包括機(jī)械力、氧化應(yīng)激及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子等在內(nèi)的多種因素可以調(diào)節(jié)經(jīng)典瞬時(shí)受體電位離子通道(transient receptor potential channel, subfamily C, TRPC)的激活[6]。TRPC1是最早被克隆的哺乳類瞬時(shí)受體電位通道，廣泛參與鈣依賴的細(xì)胞分泌和收縮過程；TRPC4參與血管收縮、微血管通透等功能[7]；TRPC5參與血管收縮、血小板聚集和減壓神經(jīng)感受血壓等功能[8]。但TRPC1、TRPC4、TRPC5形成的異聚體通道對(duì)胸主動(dòng)脈平滑肌收縮的影響尚未闡明[9]。該研究通過檢測(cè)TRPC1/C4/C5與BKCa相互作用，闡明TRPC1/C4/C5通道在調(diào)節(jié)胸主動(dòng)脈平滑肌收縮中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑與儀器 內(nèi)皮素1購(gòu)于英國(guó)Tocris Bioscience；TRPC1、TRPC4、TRPC5、BKCa抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；Protein A 磁珠購(gòu)于Millipore公司；Goat-Anti-Rabbit IgG二抗購(gòu)自上海生工公司；脂質(zhì)體3000(Lipofectamine 3000)購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；Krebs-Henseleit生理緩沖液配方(mmol/L)：NaCl 118，CaCl22.5，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO4·7H2O 1.2，NaHCO325.2和glucose 11.1；高鉀溶液為將Krebs生理緩沖液中的NaCl等摩爾替換為KCl，最終使KCl濃度為60 mmol/L；DMT myograph微血管張力記錄系統(tǒng)(model 610M, Danish Myo Technology)購(gòu)于丹麥Aarhus公司；TRPC1/C4/C5小干擾RNA(siRNA)和對(duì)照siRNA (scrambled siRNA)購(gòu)自江蘇百奧邁科生物技術(shù)有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種雄性小鼠，6周齡，體質(zhì)量20～25 g,由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，正常進(jìn)食飲水，飼養(yǎng)室溫維持(22±1)℃。

1.2 方法

1.2.1血管環(huán)的制備 將小鼠用CO2窒息處死，迅速破開胸腔，小心取出胸主動(dòng)脈，放入冰冷的Krebs緩沖液并通有混合氣體(95% O2和5% CO2)以維持溶液pH在7.4。在解剖顯微鏡下，采用精密手術(shù)剪刀快速、仔細(xì)地剝?nèi)パ芡庵镜冉M織，再用粗糙的細(xì)竹簽小心去除血管內(nèi)皮層，然后將血管沿縱軸分段為2 mm長(zhǎng)的血管環(huán)。

1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染 將各組胸主動(dòng)脈環(huán)置于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入0.9 ml DMEM培養(yǎng)基。對(duì)照組：取兩支無(wú)菌EP管，分別做好標(biāo)記，其中一管加入1.5 μl Lipofectamine 3000和50 μl OPTI-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基；另一管中加入10 μl Scrambled siRNA和50 μl OPTI-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基；用移液槍分別混勻室溫靜置5 min。隨后將兩管液體混合為一管，用移液槍充分混勻后室溫靜置10 min；實(shí)驗(yàn)組將Scrambled siRNA替換為TRPC1/4/5 siRNA。將Lipofectamine 3000包裹好的siRNA加入已提前放入一段小鼠胸主動(dòng)脈的12孔板中，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3離體胸主動(dòng)脈環(huán)張力實(shí)驗(yàn) 將兩根細(xì)金屬絲穿入血管環(huán)，把其中的一根金屬絲固定在張力換能器上，另一根金屬絲固定在可調(diào)節(jié)距離的螺桿上，在浴槽內(nèi)注入5 ml Krebs液，通入持續(xù)的混合氣體(95% O2和5% CO2)；調(diào)節(jié)張力換能器，將血管施加500 mg前負(fù)荷，運(yùn)用DMT myograph微血管張力記錄系統(tǒng)檢測(cè)血管張力，在Krebs液中平衡60 min，每隔15 min更換一次新鮮的Krebs液，待血管張力基線穩(wěn)定后，加入60 mmol/L高鉀溶液預(yù)激血管，待收縮達(dá)峰值后，用Krebs沖洗3次，再平衡后累積濃度加入10-9～10-7mol/L內(nèi)皮素1，分析張力變化曲線并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4免疫共沉淀 將siRNA處理后的胸主動(dòng)脈在冰上研磨、裂解、轉(zhuǎn)入1.5 ml 離心管中，置于冰上30～60 min，4 ℃離心后取上清液。不同樣品中分別加入抗TRPC1/C4/C5/的抗體和不同的互沉淀抗體進(jìn)行免疫共沉淀，4 ℃混合2 h后分別加入預(yù)處理好的50 μl protein A 磁珠過夜；第2天將樣品置于磁力架上吸附棄上清液。再用緩沖液清洗沉淀3次，加入5×上樣緩沖液50 μl并煮沸，收集上清液后進(jìn)行后續(xù)的Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.5Western blot 將免疫共沉淀收集的蛋白采用SDS-PAGE電泳，再以0.2 A恒流將蛋白轉(zhuǎn)入PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉膜1 h后4 ℃孵育一抗。第2天以PBST洗膜3次，再將含有蛋白的PVDF膜室溫孵育辣根過氧化物標(biāo)記的二抗1 h，PBST再漂洗3次，在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 TRPC1/C4/C5 siRNA分別敲低其蛋白表達(dá)將對(duì)照siRNA(Scrambled siRNA)和TRPC1/C4/C5 siRNA分別處理的胸主動(dòng)脈組織予以蛋白電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示TRPC1/C4/C5 siRNA分別顯著抑制了TRPC1/C4/C5蛋白的表達(dá)，見圖1。Scrambled siRNAvsTRPC1 siRNA：(124.61±18.20)%vs(91.34±23.26)%,Scrambled siRNAvsTRPC4 siRNA:(148.90±20.56)%vs(99.92±14.12)%,Scrambled siRNAvsTRPC5 siRNA:(182.72±13.11)%vs(141.76±17.83)%。

2.2 TRPC1/C4/C5 siRNA對(duì)高鉀引起的胸主動(dòng)脈收縮的影響將對(duì)照siRNA(scrambled siRNA)和TRPC1/C4/C5 siRNA分別處理的胸主動(dòng)脈環(huán)在Kreb′s緩沖液平衡穩(wěn)定后，采用高鉀溶液收縮血管，結(jié)果顯示，對(duì)照組和處理組血管收縮差異無(wú)顯著性，Scrambled siRNAvsTRPC1 siRNA: (5.07±0.68)vs(5.07±0.72)mN，(Scrambled siRNAvsTRPC4 siRNA:(4.55±0.58)vs(4.69±1.05)mN，Scrambled siRNAvsTRPC5 siRNA:(5.03±0.64)vs(5.32±0.49)mN。

2.3 TRPC1/C4/C5 siRNA對(duì)內(nèi)皮素1引起的胸主動(dòng)脈收縮的影響將對(duì)照siRNA(Scrambled siRNA)和TRPC1/C4/C5 siRNA分別處理的胸主動(dòng)脈環(huán)在Kreb’s緩沖液平衡穩(wěn)定后，采用內(nèi)皮素1收縮血管。結(jié)果見圖2所示，內(nèi)皮素1引起的血管收縮效應(yīng)在轉(zhuǎn)染TRPC1/C5 siRNA血管中顯著增強(qiáng)，而在轉(zhuǎn)染TRPC4 siRNA血管中顯著減弱。

2.4 TRPC1/C4/C5與BKCa蛋白的相互作用已知平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)流受細(xì)胞膜上BKCa蛋白的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，TRPC通道可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流，并調(diào)節(jié)BKCa的活動(dòng)。為了進(jìn)一步檢測(cè)TRPC1、TRPC4及TRPC5蛋白與BKCa之間的相互關(guān)系，本研究借助免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示TRPC1、TRPC5蛋白與BKCa存在相互作用(圖3A、C)，而TRPC4蛋白與BKCa之間不存在相互作用(圖3A、C)，并且TRPC1與TRPC4、TRPC5存在相互作用(圖3)。

圖1 TRPC1/C4/C5 siRNA對(duì)蛋白表達(dá)的影響A、B：TRPC1蛋白表達(dá)水平；C、D：TRPC4蛋白表達(dá)水平；E、F：TRPC5蛋白表達(dá)水平；與Scrambled siRNA組比較：*P<0.05

圖2 TRPC1/C4/C5 siRNA對(duì)內(nèi)皮素1引起的小鼠胸主動(dòng)脈收縮的影響A、B：TRPC1和Scrambled siRNA；C、D：TRPC4和Scrambled siRNA；E、F：TRPC5和Scrambled siRNA組；與Scrambled siRNA組比較：*P<0.05

圖3 TRPC1、TRPC4、TRPC5和BKCa蛋白相互作用

裂解液：小鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞裂解液；IP產(chǎn)物：免疫共沉淀產(chǎn)物

3 討論

鈣離子是細(xì)胞體內(nèi)重要的第二信使[3]，參與調(diào)控有機(jī)體內(nèi)眾多生物學(xué)過程，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)許多生理功能如肌肉收縮、激素分泌、細(xì)胞增殖、基因表達(dá)等[10-14]的調(diào)節(jié)也與鈣離子緊密相關(guān)。電壓依賴的鈣通道(voltage-dependent Ca2+channel, VDCC)是鈣通道之一，其介導(dǎo)的細(xì)胞外鈣內(nèi)流能夠調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的收縮，但VDCC的激活又與細(xì)胞膜電位的變化緊密相關(guān)。此外，當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著增加，BKCa可通過負(fù)反饋的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞膜電位并調(diào)節(jié)VDCC的活動(dòng)。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，已知TRPC1、BKCa蛋白形成的信號(hào)復(fù)合物以負(fù)反饋的方式調(diào)節(jié)激動(dòng)劑介導(dǎo)的血管平滑肌收縮[15]。同時(shí)，TRPC1、 TRPC4、TRPC5蛋白通常會(huì)聚集在一起，在細(xì)胞膜上形成復(fù)合通道，從而介導(dǎo)受體激活引起的鈣內(nèi)流。

為了進(jìn)一步確認(rèn)TRPC1/ C4/C5三種鈣通道蛋白之間的關(guān)系，本研究借助免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其兩兩之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TRPC1可以共沉淀TRPC4、TRPC5蛋白，表明TRPC1可與TRPC4、TRPC5之間存在相互作用，并形成異聚體通道；另一方面，TRPC1和TRPC5可以共沉淀BKCa，但TRPC4不能共沉淀BKCa，說(shuō)明TRPC1和TRPC5可以和BKCa形成信號(hào)復(fù)合物，但TRPC4不能與BKCa形成信號(hào)復(fù)合物。為了進(jìn)一步深入探討這兩種信號(hào)系統(tǒng)對(duì)血管功能的影響，本研究采用內(nèi)皮素誘導(dǎo)胸主動(dòng)脈收縮，并檢測(cè)TRPC1-TRPC4和TRPC1-TRPC5通道在內(nèi)皮素1引起的胸主動(dòng)脈收縮中的作用。同時(shí)，本研究通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染TRPC1、TRPC4、TRPC5特異性siRNA分別抑制TRPC1/C4/C5蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，特異性敲低TRPC1/C5 蛋白后內(nèi)皮素1引起的血管收縮顯著增強(qiáng)，而特異性敲低TRPC4蛋白表達(dá)后內(nèi)皮素1引起的血管收縮顯著抑制。

由此推測(cè)內(nèi)皮素激動(dòng)其受體后，激活了下游的TRPC1-TRPC5蛋白形成異聚體通道并介導(dǎo)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，進(jìn)而激活與之相互作用的BKCa通道，BKCa通道隨后介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)K+外流，使細(xì)胞膜超極化并抑制VDCC，從而負(fù)反饋抑制內(nèi)皮素1引起的血管平滑肌收縮。特異性siRNA敲低TRPC1或TRPC5蛋白表達(dá)，使得細(xì)胞膜上TRPC1-TRPC5異聚體通道表達(dá)減少，導(dǎo)致BKCa通道激活受阻，從而使VDCC活性增強(qiáng)而介導(dǎo)更多的外鈣內(nèi)流，使血管收縮增強(qiáng)。另一方面，TRPC4不能與BKCa形成信號(hào)復(fù)合物，說(shuō)明TRPC1-TRPC4異聚體通道介導(dǎo)的鈣內(nèi)流不能激活BKCa通道并形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，而相反作為受體依賴的鈣通道介導(dǎo)鈣內(nèi)流增強(qiáng)平滑肌收縮。當(dāng)TRPC4被敲低后，TRPC1-TRPC4異聚體通道介導(dǎo)的鈣內(nèi)流將減弱，而TRPC1-TRPC5異聚體通道介導(dǎo)的鈣內(nèi)流可以激活BKCa并引起細(xì)胞膜超極化，抑制VDCC，最終導(dǎo)致血管收縮減弱。