熊國紅 - 林 海 何建國 - 李應(yīng)洪 - 付湘晉 -

(1. 益陽市產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 益陽 413000；2. 中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004)

懸浮于空氣中的固態(tài)和/或液態(tài)微粒中空氣動力學當量直徑≤2.5 μm的顆粒物被稱為PM2.5。肺上皮細胞是最直接接觸PM2.5的細胞之一，已有大量研究PM2.5對肺上皮細胞的損傷及機制的報道[1]。PM2.5通過：① 引起細胞內(nèi)大量生成ROS 等自由基；② 激活NF-κB等炎性信號通路引起炎癥因子大量生成，最終導(dǎo)致細胞凋亡或者壞死[2-3]。據(jù)翟文慧等[1]報道，隨著PM2.5濃度升高、染毒時間延長，肺上皮細胞(A549細胞)中炎性因子IL-6、TNF-α表達水平顯著升高(P<0.05)；劉濤等[4]報道，PM2.5能夠造成肺上皮細胞A549的氧化損傷、炎性損傷和DNA鏈斷裂。在環(huán)境污染近期很難徹底治理好的現(xiàn)實情況下，如何避免、預(yù)防PM2.5損傷人體，已經(jīng)引起人們的普遍關(guān)注[5]。

目前有大量從抗氧化、抗炎癥角度篩選PM2.5拮抗劑的研究[6]。如大鼠口服維生素E后肺泡灌洗液中的氧化性指標LDH、MDA、ACP和AKP水平有所下降，可在一定程度上拮抗由PM2.5引起的大鼠肺組織細胞的氧化損傷[7]。王鶴潼等[8]發(fā)現(xiàn)復(fù)方精油可能通過抑制TLR4/MyD88通路及NLRP3炎癥小體活化減少IL-1β表達并抑制Th免疫反應(yīng)從而減輕PM2.5所致的急性肺炎。N-乙酰半胱氨酸(NAC)可抑制由PM2.5激活的NF-κB信號通路，降低血清和肺組織中炎性因子的表達，提高大鼠的抗氧化能力，減輕PM2.5所致肺損傷[9]。也有文獻報道發(fā)現(xiàn)一些天然產(chǎn)物可顯著拮抗PM2.5誘導(dǎo)A549細胞凋亡，如綠原酸、阿魏酸和葒草素[4]、竹葉提取物、紅豆越橘提取物[10]。

樟樹葉精油有一定的抗氧化活性和很好的抗炎活性[11]，對肺部疾病有明顯的治療作用[12]。所以，樟樹葉精油也可能對PM2.5致細胞損傷有拮抗作用，但目前還未見相關(guān)報道。而且，精油可做成氣體劑型，比上述研究所用到的口服劑型可能更易直接作用于肺部。由于肺Ⅱ型上皮細胞在體外不能傳代，人肺癌(A549)細胞具有肺Ⅱ型上皮細胞特性[13]，所以，試驗擬采用A549細胞進行試驗研究，以探究樟樹葉精油對PM2.5所致A549細胞損傷的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樟樹葉精油：以采于廈門牡丹香化有限公司基地的樟樹葉為原料，利用亞臨界萃取法萃取的精油；以正丁烷為萃取溶劑，萃取壓力8 MPa，萃取溫度50 ℃、萃取解析溫度70 ℃，萃取時間50 min；試驗所用的是桉油素型，主要成分包括β-月桂烯(0.86%)、石竹烯(4.75%)、α-石竹烯(2.62%)、桉葉油醇(24.74%)、α-萜品醇(1.07%)、芳樟醇(5.82%)、棕櫚酸(8.55%)、亞油酸(4.30%)、9,12-十八碳二烯酸(6.83%)等；

A549細胞株：中國醫(yī)學科學院細胞中心；

胎牛血清：天津市財慧生化制品廠；

PMI1640細胞培養(yǎng)基：美國Gibco公司；

CCK-8試劑盒：日本同仁化學研究所；

細胞裂解液、蛋白濃度測試盒：碧云天生物技術(shù)研究所；

胰蛋白酶：酶活2 500 U/mg，美國Sigma公司；

IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒：美國R&D公司；

MDA、SOD、CAT、T-AOC測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗儀器

大流量采樣器：G1200型，美國Andersen公司；

真空冷凍干燥機：LGJ-10型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；

冷凍離心機：TGL-16GR型，上海安亭科學儀器廠；

酶標儀：550型，美國伯樂(Bio-Rad)公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 顆粒物樣品的采集、處理 采樣時間為2016年1月，采樣地點位于長沙某城區(qū)，采樣位置離地面高度約10 m，使用G1200型大流量PM2.5采樣器(采樣流量1 m3/min)連續(xù)24 h收集大氣顆粒物，使用QM-A型石英纖維濾膜吸附顆粒物，采樣后的濾膜用鋁箔紙包好。

將吸附有PM2.5的濾膜浸泡入去離子水中，超聲處理20 min洗脫出顆粒物，將顆粒物樣品真空冷凍干燥24 h，稱重，加入PBS配制成不同濃度的PM2.5懸液，高壓滅菌，2～8 ℃冰箱保存，臨用前超聲15 min充分混勻。

1.3.2 PM2.5染毒劑量的確定 將生長狀況良好的對數(shù)期細胞用0.25%的胰蛋白酶消化，配成2×105mL-1的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，用37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，加入50，150，200，250，300 μg/mL的PM2.5懸液并繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后吸去細胞培養(yǎng)液，加入按1∶9稀釋的CCK-8溶液100 μL，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻，酶標儀檢測450 nm處吸光度(OD)值，計算細胞存活率，以存活率50%左右的PM2.5懸液濃度為后續(xù)試驗染毒劑量。

1.3.3 精油對A549細胞的保護作用 試驗分為空白對照組、PM2.5損傷組和精油保護組。用0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的A549細胞，用濃度10%胎牛血清的PMI1640細胞培養(yǎng)液，調(diào)整細胞密度2×105mL-1，1 mL/孔，接種到24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h。試驗組加入0.05，0.10，0.50，1.00，5.00，10.00 mg/mL的精油預(yù)保護6 h，棄上清液，加入200 μg/mL PM2.5 繼續(xù)作用20 h，PM2.5損傷組只加入200 μg/mL PM2.5，空白組只加入等量的PBS；然后吸去細胞培養(yǎng)液，加入按1∶9稀釋的CCK-8溶液100 μL，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻，酶標儀檢測450 nm處吸光度(OD)值，計算細胞存活率。

1.3.4 細胞存活率計算

(1)

1.3.5 細胞內(nèi)MDA、SOD、CAT、T-AOC水平測定 用直徑10 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞，精油處理后收集細胞，用4 ℃ 的PBS洗滌2遍，用細胞裂解液裂解，冷凍離心(4 ℃，1 600×g)10 min，取上清液；根據(jù)試劑盒方法測定MDA含量、SOD活性、CAT活性、T-AOC，同時測定蛋白濃度，校正細胞內(nèi)MDA、SOD、CAT、T-AOC 水平。

1.3.6 炎性因子水平測定 吸取細胞培養(yǎng)上清液按照試劑盒方法說明進行細胞炎性因子水平測定，同時測定蛋白含量，校正細胞炎性因子水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件，計數(shù)資料組間比較采用X2檢驗；計量資料用(均數(shù)±標準差)表示，采用方差分析比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PM2.5對A549細胞的毒性

從表1可以看出，PM2.5對細胞的增殖有明顯的抑制作用，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著濃度的增加，A549存活率逐漸降低。半致死劑量約在200 μg/mL，所以，后續(xù)染毒試驗均采用200 μg/mL。

表1 PM2.5劑量對A549細胞增殖的影響?

? 同列字母不同代表有顯著差異(P<0.05)。

由表1可知PM2.5濃度為0.20 mg/mL時，A549細胞存活率為(52.8±2.8)%，與文獻[10]報道基本一致。

2.2 樟樹葉精油對A549細胞增殖及存活率的影響

從表2可以看出，樟樹葉精油安全性非常高，1.0 mg/mL以內(nèi)對細胞增殖無影響，低濃度有一定促進作用；但當濃度>5 mg/mL時，對A549細胞有抑制作用。祖桂芳等[10]報道，竹葉提取物對細胞增殖的影響表現(xiàn)為低濃度(0.05，0.10 mg/mL)有促進細胞增殖的作用，而高濃度(0.20 mg/mL以上)有一定程度的抑制作用；紅豆越橘提取物對細胞增殖的影響表現(xiàn)為濃度在0.05～0.40 mg/mL時可明顯促進細胞增殖，細胞存活率最高達255%，而當濃度達到0.80～3.20 mg/mL時才顯示出抑制細胞增殖的作用。所以，樟樹葉精油對A549細胞增殖的影響與竹葉提取物、紅豆越橘提取物類似。

從表2可以看出，0.05～1.00 mg/mL樟樹葉精油對PM2.5所致的細胞毒性作用有顯著的拮抗作用(P<0.05)；但添加量達到5.0 mg/mL時，保護作用消失。樟樹葉精油在高濃度時對細胞的抑制作用可能與其主要成分桉葉油醇的細胞毒性有關(guān)。

表2 樟樹葉精油濃度對A549細胞存活率的影響

? 同列字母不同代表有顯著差異(P<0.05)。

2.3 樟樹葉精油對A549細胞胞內(nèi)氧化應(yīng)激的影響

氧化損傷是PM2.5細胞毒性的主要機制之一。丙二醛(MDA)含量、SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)等是表征細胞氧化還原狀態(tài)最常用的指標。MDA是最常見脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量廣泛用于反映細胞脂質(zhì)氧化程度。SOD、CAT、GSH-Px是細胞的抗氧化防御系統(tǒng)重要組成部分，可阻止活性氧的產(chǎn)生或者清除活性氧[14]。從表3 可以看出，PM2.5損傷細胞后MDA 含量顯著增高(P<0.05)。劉婷等[15]發(fā)現(xiàn)，PM2.5損傷肺巨噬細胞24 h，細胞內(nèi)SOD、CAT活性和T-AOC均明顯降低，大于33 μg/mL的PM2.5可使MDA顯著升高(P<0.05)。表3還表明，樟樹葉精油可顯著降低染毒細胞中MDA含量，增加SOD、CAT活性和T-AOC含量(P<0.05)，表明樟樹葉精油可通過抗氧化應(yīng)激拮抗PM2.5致細胞毒性。

2.4 樟樹葉精油對A549細胞炎性因子的影響

PM2.5濃度升高及暴露時間延長可能導(dǎo)致機體炎癥反應(yīng)增強，從而造成機體損害[16]。TNF-α、IL-6均為介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，由單核巨噬細胞、自然殺傷細胞等分泌。TNF-α是機體炎癥介質(zhì)連鎖反應(yīng)中的啟動因子、中心介質(zhì)[17]。TNF-α能調(diào)節(jié)IL-1、IL-6等其他細胞炎癥因子的釋放。IL-6是急性炎癥反應(yīng)的主要標志物之一，來源于多種細胞[18-19]。因此，檢測肺上皮細胞A549的IL-6、TNF-α含量，可以推斷樟樹葉精油拮抗PM2.5致肺上皮細胞炎性反應(yīng)的機制。

表3 樟樹葉精油對A549細胞中MDA、SOD、CAT和T-AOC的影響?

? 同列字母不同代表有顯著差異(P<0.05)。

由表4可以發(fā)現(xiàn)：樟樹葉精油可顯著降低染毒細胞中炎性因子TNF-α、IL-6的含量(P<0.05)；表明樟樹葉精油可通過抑制炎癥反應(yīng)拮抗PM2.5致細胞毒性。此前，焦周光等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在染毒濃度為100 μg/mL及以上時，PM2.5可使細胞IL-6分泌量顯著增加。試驗獲得類似結(jié)果。

表4樟樹葉精油對炎性因子TNF-α、IL-6含量的影響?

Table 4 Effects of camphor leaves’essential oil on PM2.5(0.2 mg/mL)induced TNF-αand IL-6(n=3)

組別TNF-α/(pg·mL-1)IL-6/(pg·mL-1)空白140±10e70±10dPM2.5600±30a230±20a精油0.05 mg/mL310±10b140±20b精油0.10 mg/mL200±10d70±10d精油0.50 mg/mL220±20cd80±10cd精油1.00 mg/mL250±10c90±10c

? 同列字母不同代表有顯著差異(P<0.05)。

3 結(jié)論

樟樹葉精油安全性較高，1.0 mg/mL以內(nèi)對細胞增殖無影響；0.05～1.00 mg/mL樟樹葉精油對PM2.5所致的細胞毒性作用有顯著的拮抗作用(P<0.05)。通過抗氧化應(yīng)激及抑制炎癥反應(yīng)可能是樟樹葉精油拮抗PM2.5致細胞毒性的機制。但由于樟樹葉精油成分復(fù)雜，其準確的活性成分還需要進一步研究確認。