陳玉秀 - 彭必武 - 李雨嫣 -

(湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

川貝母是清咽潤(rùn)喉類保健食品中常見(jiàn)的原料，為藥用植物川貝母的干燥鱗莖[1]。由于川貝母價(jià)格貴，市場(chǎng)零售價(jià)在4.8～6.8元/g，粉碎后易與其他同源植物，特別是浙貝母混淆。因此在《中國(guó)藥典》中，采用了分子生物學(xué)鑒定方法對(duì)川貝母進(jìn)行鑒別，即通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)健拗菩詢?nèi)切酶多態(tài)性分析(PCR-RFLP)技術(shù)，將川貝母正品特異性的DNA條帶與偽品進(jìn)行區(qū)別。該方法具有特異性強(qiáng)、微量、準(zhǔn)確等特點(diǎn)[2]，但該方法步驟復(fù)雜，操作費(fèi)時(shí)。

堿裂解法是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性及復(fù)性的差異進(jìn)行分離，利用高pH使質(zhì)粒DNA和染色體DNA變性，同時(shí)沉淀蛋白質(zhì)，再將pH值調(diào)至中性，由于質(zhì)粒DNA較小，容易復(fù)性成雙鏈，而染色體DNA較大，纏結(jié)成網(wǎng)狀不溶物質(zhì)，從而通過(guò)離心除去。這種方法具有操作簡(jiǎn)單、提取速度快、價(jià)格低廉、通量大等優(yōu)點(diǎn)[3]，現(xiàn)已廣泛用于小麥、玉米、花生、水稻[4]、番茄[5]、甜菜[6-7]等經(jīng)濟(jì)作物，在分子輔助育種、轉(zhuǎn)基因植物鑒定、SSR鑒定等方面起到重要作用，也可用于中藥材鑒定[8]，在鑒定過(guò)程中，提取高質(zhì)量、高純度的基因組DNA是開展該方面研究工作的前提和關(guān)鍵過(guò)程[9]。但不同的生物樣本，堿裂解液不同。

試驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)川貝母DNA提取所用堿裂解液進(jìn)行篩選，旨在獲得一種快速鑒別川貝母的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貝母：從產(chǎn)地、藥材市場(chǎng)及藥店購(gòu)買25個(gè)樣品(見(jiàn)表1)，所有樣品經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)周日寶教授鑒定，其中1號(hào)樣品為正品川貝母，所有樣品依次用75%乙醇、滅菌超純水清洗，吸干表面水分，置乳缽中研磨成極細(xì)粉；

2-嗎啉乙磺酸(MES)、聚乙二醇4000(PEG4000)、曲拉通100(Triton X-100)：北京索來(lái)寶科技有限公司；

Low ladder(標(biāo)準(zhǔn)DNA分子)：廣州東盛生物科技有限公司；

交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)：生工生物工程(上海)股份有限公司；

表1 貝母樣品?

?※為對(duì)照樣本。

rTaq酶(250 U)、SmaI酶(100 U)、10x聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)緩沖液：日本TakaRa公司；

核糖核酸酶(RNaseA)：100 U，天根生物科技(北京)有限公司；

脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)：江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司；

引物5′CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3′和5′GCTACGTTCTTCATCGAT3′：湖南艾佳生物科技股份有限公司；

乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉、氯化銅等：分析純，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

核酸定量?jī)x：NanoDrop Lite型，美國(guó)Thermo公司；

超低溫冰箱：Forma702型，美國(guó)Thermo公司；

低溫臺(tái)式離心機(jī)：16K-R型，長(zhǎng)沙鑫奧儀器儀表有限公司；

醫(yī)用凈化工作臺(tái)：SE-CJ-2D型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

熒光定量PCR儀：7300型，美國(guó)ABI 公司；

PCR儀：THERM-1000型，美國(guó)Axygen公司；

電泳儀：DYY-6C型，北京六一儀器廠；

凝膠成像系統(tǒng)：5000 Plus型，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 堿裂解法的篩選 堿裂解液的配置參照表2。取1號(hào)川貝母樣品10份各30 mg于1.5 mL離心管中，分別加入PA1～PA10提取緩沖液400 μL及RNaseA 0.5 μL，用漩渦振蕩器振蕩10～15 s，混勻，65 ℃水浴加熱5 min，取出。在PA1～PA5緩沖液管中分別加入0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 130 μL，在PA6～PA10緩沖液管中分別加入0.3 mol/L NaAc(pH 5.0)130 μL。分別經(jīng)漩渦混勻，冰浴冷卻3 min，14 000 r/min離心3 min；吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入等體積(含6.0 mol/L氯化銅溶液，pH 5.5)25 mmol/L MES液，5 mmol/L MgCl2液及0.05% Triton X-100混合溶液，混勻，加到吸附柱上，10 000 r/min 離心1 min，棄過(guò)濾液，加入5 mol/L鹽酸胍、25 mmol/L MES、2 mmol/L氯化鎂溶液及0.05% Triton X-100混合溶液500 μL，10 000 r/min離心1 min，棄過(guò)濾液；再加入Tris-Base緩沖液500 μL，10 000 r/min離心1 min，棄過(guò)濾液；取出吸附柱，放入另一離心管中，加入50 μL洗脫緩沖液，室溫放置3 min，10 000 r/min離心1 min，將洗脫液再加入吸附柱中，室溫放置2 min，10 000 r/min 離心1 min，取洗脫液，在核酸定量?jī)x上測(cè)定濃度與純度。

表2 堿裂解液配方?

? N：0.5 mol/L氫氧化鈉；PVPP：1%聚乙烯聚吡咯烷酮40；NaCl：200 mmol/L氯化鈉液；MgCl2：5 mmol/L氯化鎂液；EDTA：2 mmol/L乙二胺四乙酸液；SDS：1%十二烷基硫酸鈉；PEG：40%聚乙烯二醇4000；Tr：1%曲拉通100；PVP：1%聚乙烯吡咯烷酮；Ac：醋酸鈉液；Tris：10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸液。

1.3.2 PCR-RFLP反應(yīng)及電泳檢測(cè)

(1) 鑒別引物：5′CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3′和5′GCTACGTTCTTCATCGAT3′。

(2) PCR反應(yīng)體系：200 μL離心管中進(jìn)行，反應(yīng)體系總體積30 μL，包括10×PCR緩沖液3 μL，二氯化鎂(25 mmol/L) 2.4 L， dNTP(10 mmol/L) 0.6 μL，上游引物(30 μmol/L) 0.5 μL，下游引物(30 μmol/L) 0.5 μL，高保真Taq DAN聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，模板1 μL，無(wú)菌超純水21.8 μL。

(3) PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性4 min，循環(huán)反應(yīng)30次(95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸5 min。取PCR反應(yīng)液，置500 μL離心管中，進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積20 μL，包括10×酶切緩沖液2 μL，PCR反應(yīng)液6 μL，Sma I(10 U/μL)0.5 μL，無(wú)菌超純水11.5 μL，酶切反應(yīng)在30 ℃水浴2 h。另取無(wú)菌超純水，同上述PCR-RFLP反應(yīng)操作，進(jìn)行空白對(duì)照。

(4) 電泳檢測(cè)：參照瓊脂糖凝膠電泳法(中國(guó)藥典四部通則0541)，膠濃度1.5%，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed；供試品與對(duì)照藥材酶切反應(yīng)溶液的上樣量分別為8 μL，DNA分子量標(biāo)記上樣量1 μL(0.5 μg/μL)。電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)OD260 nm/OD280 nm的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 堿裂解液的確定

由圖1可知，通過(guò)10種不同的堿裂解液所提DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，都能擴(kuò)增出條帶，以PA5擴(kuò)增出的條帶最成功、最清晰。10種堿裂解液中分別用到了SDS、PVP、PVPP、PEG、曲拉通100、EDTA、NaCl、Tris-HCl等試劑，在DNA提取中具有不同的作用。PA5裂解液中用到了PVP、EDTA、曲拉通100等，并用Tris-HCl為中和劑，PCR擴(kuò)增后電泳圖結(jié)果較好，DNA濃度稍低，但OD值為1.84，接近純品DNA(如表3所示)。這可能與裂解液中PVP等有關(guān)，有文獻(xiàn)[10]報(bào)道PEG、PVP可降低DNA濃度。但整體而言，以Tris-HCl為中和劑的裂解液比以醋酸鈉為中和劑的裂解液所得DNA濃度及純度好。因此選擇PA5堿裂解液作為川貝母DNA提取液，并對(duì)1號(hào)樣品進(jìn)行PCR-RFLP反應(yīng)和電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

1. Marker 2～11. 對(duì)應(yīng)表2中的PA1～PA10裂解液

Figure 1 DNA electrophoresis maps of fritillaria cirrhosae bulbus extracted from 10 kinds of alkali lysis solutions

M. Marker 1. 對(duì)照樣

圖2顯示對(duì)照樣在100～250 bp有兩條清晰的DNA條帶，可見(jiàn)利用PA5堿裂解液進(jìn)行川貝母DNA提取并進(jìn)行PCR-RFLP反應(yīng)和電泳檢測(cè)，同樣可以滿足《中國(guó)藥典》利用分子生物學(xué)鑒別法對(duì)川貝母進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)鑒別的目的。

2.2 新方法驗(yàn)證

由表4可知，同一樣品，用藥典法和試驗(yàn)方法在提取時(shí)間和成本上均有所不同。試驗(yàn)方法比藥典法的提取時(shí)間要節(jié)省15～20 min，且單個(gè)樣品的檢驗(yàn)成本顯著降低。

2.3 試驗(yàn)方法對(duì)不同川貝母樣品的檢測(cè)

利用試驗(yàn)方法對(duì)25個(gè)流通市場(chǎng)上所銷售的貝母進(jìn)行DNA提取，PCR后進(jìn)行酶切前的電泳檢測(cè)，對(duì)有電泳條帶的樣品進(jìn)行RFLP檢測(cè)，結(jié)果如圖3～5。

由圖3～5可知，1號(hào)作為對(duì)照樣在100～250 bp處有2條清晰條帶，且條帶均勻清晰，2、3、4、12、13、15、21、22、24號(hào)樣品與1號(hào)樣品一致，可鑒定為正品，而其他樣品與1號(hào)樣品不一致，且結(jié)合外觀性狀，可判定為川貝母?jìng)纹贰?/p>

表3 PA1～PA10堿裂解液提取DNA濃度與純度及電泳結(jié)果

表4 兩種方法對(duì)比

M. Marker 1～6. 對(duì)應(yīng)表1中相同序號(hào)的貝母樣品

M. Marker 1、7～11. 對(duì)應(yīng)表1中相同序號(hào)的貝母樣品CK. 空白

M. Marker 1、12～24. 對(duì)應(yīng)表1中相同序號(hào)的貝母樣品

3 結(jié)論

試驗(yàn)研究了采用堿裂解法提取川貝母DNA的裂解液配比比例及方法，篩選獲得了200 mmol/L NaCl液，5 mmol/L MgCl2液，1% Triton X-100，1% PVP，2 mmol/L EDTA，1% SDS，0.1 mol/L Tris-HCl的裂解液可用于川貝母的DNA提取，此法不僅提取成本較《中國(guó)藥典》方法中規(guī)定的商品試劑盒費(fèi)用顯著低，而且操作簡(jiǎn)便、快捷，符合相關(guān)保健食品企業(yè)對(duì)川貝母快速鑒定的需求。由于貝母有多種入藥形式(完整藥材、破碎飲片、粉末)，后續(xù)應(yīng)針對(duì)基因組提取的正確取樣方法進(jìn)行研究，尤其是川貝母正品中摻混有少量偽品時(shí)。