陳 政 朱涵予 -

(衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽 421000)

銀耳是一種可食用的膠質(zhì)菌，具有極高的食用、藥用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，歷來受到中國及東南亞國家人們的喜愛[1]。銀耳中富含多糖、蛋白質(zhì)、維生素、微量元素、黃酮類和多酚類營養(yǎng)物質(zhì)[2-3]。佀國涵等[4]分別提取銀耳芽孢、菌絲體和子實(shí)體中的凝集素，發(fā)現(xiàn)3種材料中凝集素的凝集活性和穩(wěn)定性均不相同。Li等[5]提取了銀耳子實(shí)體中主要的酚酸類化合物如4-對(duì)羥基苯甲酸、龍膽酸、4-香豆酸并測定其抗氧化活性。劉洋等[6]建立了銀耳芽孢總蛋白的提取方法。還有大量研究[7-9]通過改變銀耳菌絲體和芽孢的發(fā)酵條件以提高銀耳多糖產(chǎn)量。銀耳芽孢具有易培養(yǎng)、生長速度快的優(yōu)點(diǎn)，可運(yùn)用于食品領(lǐng)域，已開發(fā)了許多產(chǎn)品如銀耳芽孢發(fā)酵液、芽孢多糖粉[10]。而在營養(yǎng)成分方面的研究主要集中在銀耳菌絲體和子實(shí)體上，對(duì)芽孢研究鮮有報(bào)道[9]，且僅針對(duì)銀耳多糖，此領(lǐng)域空白較多。

RNA-Seq可準(zhǔn)確研究所有mRNA的豐度信息，從RNA水平分析細(xì)胞代謝和基因表達(dá)與一些生命現(xiàn)象的關(guān)系，通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組差異的研究，得到大量的關(guān)于功能基因、代謝途徑的相關(guān)信息[11-12]。通過研究銀耳芽孢和菌絲整體基因的表達(dá)變化，可進(jìn)一步了解銀耳中營養(yǎng)物質(zhì)的代謝途徑，挖掘功能基因。RNA-Seq在雙孢蘑菇[13]、牛樟芝[14]、冬蟲夏草[15]、靈芝[16]、茯苓[17]、灰樹花[18]等食藥用真菌中均有應(yīng)用。

試驗(yàn)選用銀耳雙核菌絲M1332及其2個(gè)單核親本芽孢Y13、Y32為材料，運(yùn)用RNA-Seq進(jìn)行比較分析，全面探討銀耳芽孢到菌絲生長過程中的基因表達(dá)量的變化，分析此過程涉及的代謝途徑及相關(guān)功能基因，以期為銀耳的代謝調(diào)控、功能基因的克隆等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

銀耳雙核菌絲M1332及其2個(gè)單核親本芽孢Y13、Y32：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；

三氯甲烷、乙醇、異丙醇：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

焦炭酸二乙酯(DEPC)：分析純，上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；

RNaisoTMplus：大連寶生物工程有限公司；

TransScript?first-strand cDNA Synthesis Supermix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TransStart?Green qPCR SuperMix試劑盒：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高速離心機(jī)：5418R型，德國Eppendorf AG公司；

Nanodrop分光光度計(jì)：NanoDrop 3300型，美國Thermo Scientific公司；

熒光定量PCR儀：ABI Prism7900型，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；

電泳儀：DYCP-31DN型，北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌絲20 d，芽孢培養(yǎng)7 d后收集菌體提取RNA。采用RNaisoTMplus試劑盒提取總RNA，詳細(xì)操作參照產(chǎn)品說明書。通過瓊脂糖凝膠電泳、測定A260/280和A260/230以檢測RNA質(zhì)量。檢測合格的總RNA委托深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行 Illumina HiseqTM4000測序。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組文庫的數(shù)據(jù)組裝 測序所得raw reads數(shù)據(jù)，過濾去除低質(zhì)量、包含接頭污染及未知堿基含量>5% 的reads，得到clean reads。利用Trinity(version 2.0.6)軟件對(duì)clean reads進(jìn)行denovo組裝[19]。通過序列之間的overlap信息組裝得到contigs，根據(jù)序列的Paired-end信息將contigs組裝得到轉(zhuǎn)錄本序列。最后用Tgicl(version 2.0.6)進(jìn)行聚類去冗余得到Unigene。

使用Blastx對(duì)Unigene進(jìn)行NR、NT、Swiss-Prot、COG、KEGG注釋，使用InterProScan5(version 5.11)進(jìn)行InterPro注釋，使用Blast2GO(version 2.5.0)以及NR注釋結(jié)果進(jìn)行GO(Gene Ontology)注釋。根據(jù)功能注釋結(jié)果，按Blastdb優(yōu)先級(jí)確定Unigene的CDs序列。以上數(shù)據(jù)庫未能得到注釋的Unigene則使用ESTScan(version 3.0.2)進(jìn)行預(yù)測確定其序列及方向。

1.2.3 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析 每個(gè)樣品采用FPKM(reads per kb per million reads)方法計(jì)算基因的表達(dá)量。并用倍數(shù)變化法篩選兩樣本之間的差異表達(dá)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.01且倍數(shù)差異≥2。

將3個(gè)樣本間獲得的差異表達(dá)基因根據(jù)KEGG注釋的結(jié)果以及官方分類，將差異表達(dá)基因進(jìn)行生物通路分類，用R軟件中的phypen函數(shù)進(jìn)行富集分析，篩選出顯著性富集的通路Pathway(定義q值<0.05為在差異表達(dá)基因中顯著富集的通路)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)檢測分析 不同樣品的總RNA反轉(zhuǎn)錄后采用TransStart?Green qPCR SuperMix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，具體試驗(yàn)步驟參照產(chǎn)品說明書。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性30 s，再進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，包括94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，于ABI Prism7900熒光定量PCR儀上進(jìn)行。以銀耳β-tubulin作為內(nèi)參，繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt進(jìn)行分析。設(shè)計(jì)的基因及其引物序列分別為β-tubulin(F：5′-GATGACCATTTCTTGCTTC-3′，R：5′-GTTCTGACATTTGCTACCG-3′)；CL131.contig1(F：5′-CCGCCTTGGTCTTCCTCATT-3′，R：5′-TAGTTGCTCCCGCCCTTGTA-3′)；CL2725.contig1(F：5′-GGCAGCCGACAAGCGACATA-3′，R：5′-ACCACCGCAGGCGA-CGAAAT-3′)；unigene3454(F：5′-CTCTCGTCTACAAGGGCTCC-3′，R：5′-GAGGAAGAAAGGGCGA-ACTG-3′)，委托武漢天一輝遠(yuǎn)公司合成引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀耳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的產(chǎn)出及組裝

建庫測序單個(gè)樣品測序深度>4.24 Gb，獲得13.16 Gb堿基序列信息，各樣品的測量結(jié)果準(zhǔn)確度Q30(序列的測序錯(cuò)誤率低于0.1%的比例)>93.04%，GC含量57.95%～58.10%，clean reads占raw reads的比例>86.27%，過濾后reads>28.25 Mb(表1)，說明測序質(zhì)量較好，數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步組裝分析。

利用Trinity(version 2.0.6)軟件對(duì)過濾后的所有clean reads序列進(jìn)行denovo組裝，獲得的轉(zhuǎn)錄本通過Tgicl進(jìn)一步去冗余篩選，得到的Unigene共計(jì)16 190條，總的長度27 939 037 bp，平均長度1 725 bp，GC含量57.98%，N50(指從組裝最長的Unigene依次向下求長度的總加和，當(dāng)累加長度達(dá)到組裝長度的1/2時(shí)，對(duì)應(yīng)的Unigene長度為N50長度)為2 541 bp。對(duì)組裝的Unigene長度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，大于3 000 bp的2 558條，小于3 000 bp 的片段分布均勻，數(shù)目分布上與N50結(jié)果較為一致，說明denovo組裝結(jié)果較好。

2.2 Unigene的注釋

組裝完畢后，對(duì)Unigene進(jìn)行NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot和Interpro數(shù)據(jù)庫注釋，結(jié)果顯示，12 458條在NR數(shù)據(jù)庫里匹配到同源基因，占所有Unigene的76.95%；其他數(shù)據(jù)庫依次為32.95%，59.09%，61.71%，44.49%，53.93%，24.22%。以NR數(shù)據(jù)庫為例進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，有12 458條Unigene在NR數(shù)據(jù)庫中可找到相似序列。其中，55.75%的Unigene比對(duì)到金黃銀耳(T.mesenterica)，13.35%比對(duì)到新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)。根據(jù)注釋結(jié)果共檢測出12 366個(gè)CDs，未注釋上的Unigene使用ESTScan預(yù)測后獲得975個(gè)CDs。同時(shí)還檢測出1 105個(gè)SSR位點(diǎn)，以及預(yù)測出553個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子的Unigene。

表1 各樣本測序產(chǎn)出數(shù)據(jù)?

? Q30：序列的測序錯(cuò)誤率<0.1%的比例。

2.3 COG注釋

將所有Unigene與COG數(shù)據(jù)庫比對(duì)，結(jié)果顯示，共有7 203條Unigene在COG數(shù)據(jù)庫中找到同源信息，共被分成25大類(圖1)，其中常規(guī)功能預(yù)測最多，共有2 339條，占所有分類的32.47%。其次有1 588條預(yù)測到碳水化合物的運(yùn)輸和代謝，為銀耳中碳水化合物如銀耳多糖的研究提供基礎(chǔ)。核酸結(jié)構(gòu)預(yù)測得到的最少，僅有2條，其他類別的基因表達(dá)豐度各不相同。

2.4 GO分析

結(jié)合GO數(shù)據(jù)庫對(duì)所有Unigene進(jìn)行功能分類，結(jié)果顯示，共有3 921條Unigene被注釋到了GO分類上(圖2)。其中樣本基因數(shù)量在1 000條以上的生物過程分類中主要聚集于代謝過程(1 870個(gè))、細(xì)胞過程(2 032個(gè))和單一有機(jī)體的過程(1 454個(gè))；在細(xì)胞組分主要聚集于細(xì)胞(1 706個(gè))、細(xì)胞成分(1 696個(gè))、細(xì)胞器(1 177個(gè))和生物膜(1 184個(gè))；在分子功能分類中主要聚集于蛋白結(jié)合(1 227個(gè))和催化活性(1 614個(gè))。

A. 翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成 B. 轉(zhuǎn)錄 C. 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 D. 次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝 E. RNA加工與修飾 F. 復(fù)制、重組和修復(fù) G. 翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶 H. 核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝 I. 核結(jié)構(gòu) J. 脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝 K. 細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和囊泡運(yùn)輸 L. 無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝 M. 一般功能預(yù)測 N. 未知功能 O. 胞外結(jié)構(gòu) P. 能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化 Q. 防御機(jī)制 R. 細(xì)胞骨架 S. 輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝 T. 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué) U. 細(xì)胞壁/膜/膜的生成 V. 細(xì)胞運(yùn)動(dòng) W. 細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂、染色體分隔 Y. 碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝 Z. 氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝

圖1 銀耳Unigene的COG分類

Figure 1 COG functional classifications of all Unigene

2.5 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

銀耳菌絲M1332與芽孢Y13、Y32相比，上調(diào)的基因分別為2 296，3 533個(gè)，下調(diào)的基因分別為3 207，2 754個(gè)，芽孢Y13、Y32相比，上調(diào)的基因?yàn)? 803個(gè)，下調(diào)的基因?yàn)? 773個(gè)(圖3)。

將鑒定出來的差異表達(dá)基因，進(jìn)行KEGG富集分析。結(jié)果顯示，7個(gè)通路富集水平顯著，包括細(xì)胞內(nèi)噬、代謝途徑、減數(shù)分裂、氨基糖和核酸糖的代謝、酪氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸的代謝、丙氨酸和天冬氨酸以及谷氨酸的代謝(表2)。

1. 生物階黏附 2. 生物調(diào)節(jié) 3. 細(xì)胞組分的組織與生物合成 4. 細(xì)胞過程 5. 發(fā)育過程 6. 定位建立 7. 生長 8. 定位 9. 運(yùn)動(dòng) 10. 代謝過程 11. 多細(xì)胞有機(jī)體過程 12. 多細(xì)胞生物過程 13. 生物過程正向調(diào)控 14. 生物過程負(fù)向調(diào)控 15. 生物過程調(diào)控 16. 生殖 17. 生殖過程 18. 應(yīng)激反應(yīng) 19. 信號(hào) 20. 單機(jī)體過程 21. 細(xì)胞 22. 細(xì)胞組分 23. 胞外區(qū) 24. 胞外區(qū)組分 25. 大分子復(fù)合物 26. 膜 27. 膜組分 28. 膜封閉內(nèi)腔 29. 擬核 30. 細(xì)胞器 31. 細(xì)胞器組分 32. 病毒 33. 病毒組分 34. 抗氧化活性 35. 連接 36. 催化活性 37. 電子載體活性 38. 酶調(diào)節(jié)活性 39. 鳥苷酸交換因子活性 40. 分子傳感器活性 41. 核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性 42. 蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性 43. 蛋白標(biāo)簽 44. 受體活性 45. 結(jié)構(gòu)分子活性 46. 轉(zhuǎn)運(yùn)活性

圖2 銀耳Unigene的GO分類

Figure 2 Gene ontology classifications of all Unigene

FDR：錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率 FC：差異倍數(shù)。

通過對(duì)菌絲M1332、芽孢Y13、Y32的KEGG富集分析，差異表達(dá)基因主要富集在氨基酸代謝通路上，說明在兩親本芽孢配對(duì)形成菌絲的過程中有許多氨基酸代謝相關(guān)基因協(xié)同調(diào)控參與。而芽孢Y13、Y32的差異基因KEGG富集分析的結(jié)果顯示，此過程中兩芽孢的基因表達(dá)情況既有協(xié)同又有分工。

菌絲與芽孢相比，差異基因均有富集在氨基糖和核酸糖代謝途徑上，說明在芽孢形成菌絲的過程中兩芽孢均有基因參與此代謝途徑。氨基糖作為微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是許多生物大分子如抗生素、殼聚糖、糖蛋白、脂多糖和黏多糖等的組成成分。在氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下，L-谷氨酸或谷氨酰胺上的氨基取代了磷酸糖或核酸糖上的羥基而形成氨基糖。被氨基取代后，糖的理化性質(zhì)和生物功能會(huì)發(fā)生顯著變化[20]。核酸糖，因其能形成高鍵能的糖苷鍵(ΔG°>-29.288 kJ/mol)而廣泛參與多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、脂多糖等的合成[21]。氨基糖和核酸糖代謝途徑的相關(guān)轉(zhuǎn)錄組信息為今后銀耳中生物大分子的代謝研究提供參考。

此外，大部分差異基因富集在氨基酸代謝通路中。谷氨酰胺酶能將谷氨酰胺脫氨后形成谷氨酸，經(jīng)過一系列還原反應(yīng)生成脯氨酸和天冬氨酸。谷氨酰胺來源的谷氨酸還可以通過供給氨基的方式參與其他氨基酸的合成，如丙氨酸[22]。研究[23-24]顯示，癌細(xì)胞中谷氨酰胺酶的含量比正常細(xì)胞高，小鼠模型中谷氨酰胺酶基因的缺失推遲了肝癌細(xì)胞的腫瘤形成。氨基酸合成相關(guān)基因還參與其他生物學(xué)過程如KEGG富集得到的代謝通路減數(shù)分裂中?；疑w鬼傘的脯氨酸富集蛋白基因參與減數(shù)分裂過程，該基因的突變體具有擔(dān)孢子產(chǎn)量減少，孢子存活率低且無法進(jìn)行完整的減數(shù)分裂過程的現(xiàn)象[13]。

表2 KEGG通路富集分析?

?q值越小表示該通路富集水平越顯著，p值越小表示在該通路可信度越高。

2.6 qRT-PCR表達(dá)分析

隨機(jī)挑選3個(gè)KEGG富集分析結(jié)果中的差異表達(dá)基因，設(shè)計(jì)定量引物，驗(yàn)證相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。定量結(jié)果表明，qRT-PCR驗(yàn)證的3個(gè)基因在3個(gè)材料中的表達(dá)量改變倍數(shù)與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致(圖4)，測序結(jié)果較為準(zhǔn)備可信，可供后續(xù)研究參考。

圖4 差異基因的定量表達(dá)分析

3 結(jié)論

試驗(yàn)對(duì)銀耳菌絲和芽孢進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，了解了芽孢配對(duì)形成菌絲這一過程中全部基因的表達(dá)情況，獲得了大量相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本信息。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的深入挖掘有利于全面了解銀耳菌絲和芽孢中基因信息和表達(dá)差異情況，今后應(yīng)開展銀耳在菌絲和芽孢兩個(gè)時(shí)期的多糖和氨基酸等的合成和代謝途徑相關(guān)差異表達(dá)基因的克隆和基因功能方面的研究。