王 輝 秦翠麗 - 宮 強(qiáng) 牛明福 - 趙思琪 - 席振軍 -

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2. 國家級食品加工與安全實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，河南 洛陽 471023)

非消化性寡糖(Non-digestible oigosaccharies, NDOs)是一類具有降低血糖、血脂和血清膽固醇及提高動物機(jī)體免疫力、增強(qiáng)造血功能、促進(jìn)礦物質(zhì)元素吸收、改善消化道菌群結(jié)構(gòu)、提高機(jī)體抗氧化等多種生理功能的新型功能性低聚糖[1-5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，非消化寡糖的分解能產(chǎn)生一些抗菌類物質(zhì)及下調(diào)腸道pH，從而有效抑制大腸桿菌等有害菌的生長，維持腸道健康。

目前關(guān)于單一非消化性寡糖的研究報(bào)道較多，而將不同寡糖進(jìn)行組合的研究報(bào)道甚少，僅研究組合情況對益生菌發(fā)酵的影響[7]，而組合情況對動物機(jī)體非特性免疫機(jī)能的研究尚未見報(bào)道。為探討不同非消化性寡糖組合對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的影響，試驗(yàn)擬將低聚果糖(Fructo oligosaccharide, FOS)、低聚木糖(Xylo oligosaccharide, XOS)和低聚半乳糖(Galactooligosaccharides, GOS)3種非消化寡糖及其不同組合對小鼠進(jìn)行灌胃試驗(yàn)，通過測定不同免疫指標(biāo)，研究其對小鼠免疫性能的影響，旨在為非消化害糖的綜合應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

小鼠：體重為18～20 g雌性BALB/c小鼠，河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；

綿羊紅細(xì)胞、豚鼠補(bǔ)體：鄭州百基生物工程有限公司；

四甲基偶氮唑鹽：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；

刀豆蛋白A：北京索萊寶科技有限公司；

二硝基氟苯：98%，上海麥克林生化科技有限公司；

印度墨汁：福州飛凈生物科技有限公司；

都氏試劑、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚半乳糖：95%，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平：JA230T型，渡揚(yáng)精密儀器(上海)有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-2D型，蘇州凈化設(shè)備公司；

紫外分光光度計(jì)：755B型，上海菁華儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分組及飼喂 將140只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為7組：空白對照組，低聚果糖組、低聚木糖組、低聚半乳糖組、低聚木糖與低聚半乳糖(2∶3，質(zhì)量比)復(fù)合組、低聚木糖與低聚果糖(2∶1，質(zhì)量比)復(fù)合組、低聚半乳糖與低聚果糖(2∶1，質(zhì)量比)復(fù)合組。按400 mg/kg(以體重計(jì))的劑量分別進(jìn)行灌胃，每日1次，連續(xù)15 d；對照組小鼠正常狀態(tài)下飼喂。

1.3.2 小鼠免疫器官指數(shù)測定 連續(xù)灌胃15 d后，每組隨機(jī)選取5只小鼠進(jìn)行小鼠免疫器官指數(shù)測定，按式(1)計(jì)算小鼠免疫器官指數(shù)。

(1)

式中：

c——脾臟或胸腺指數(shù)，mg/g；

m1——脾臟或胸腺質(zhì)量，mg；

m2——小鼠體重，g。

1.3.3 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(Delayed type hypersensitivity, DTH)檢測 第15 天灌胃2 h后，參考文獻(xiàn)[8-10]方法，每組隨機(jī)取5只小鼠進(jìn)行檢測，按式(2)計(jì)算DTH反應(yīng)程度。

c=m1-m2，

(2)

式中：

c——DTH反應(yīng)程度,g；

m1——小鼠右耳質(zhì)量，g；

m2——小鼠左耳質(zhì)量，g。

1.3.4 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力測定 參考文獻(xiàn)[11-13]方法，每組隨機(jī)選取5只小鼠，按式(3)計(jì)算小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力。

(3)

(4)

式中：

c——小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力；

m1——小鼠體重，g；

m2——肝質(zhì)量，g；

m3——脾質(zhì)量，g；

m4——未校正的吞噬指數(shù)；

m5——2 min血樣光密度值的對數(shù)值；

m6——10 min血樣光密度值的對數(shù)值；

m7——時(shí)間，10 min；

m8——時(shí)間，2 min。

1.3.5 小鼠血清溶血素的測定 參考文獻(xiàn)[14-15]方法，每組隨機(jī)選取5只小鼠，按式(5)計(jì)算小鼠的血清溶血素值(half value of hemolysin,HC50)。

(5)

式中：

c——小鼠的血清溶血素值；

m1——樣品OD值；

m2——綿羊紅細(xì)胞半數(shù)溶血OD值；

m3——稀釋倍數(shù)。

1.3.6 脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[16-18]方法，取1.3.2無菌采集的5只小鼠脾臟進(jìn)行試驗(yàn)，脾淋巴細(xì)胞增殖情況用刺激值(stimulation index, SI)表示，按式(6)進(jìn)行計(jì)算。

(6)

式中：

c——刺激值,用來表示脾淋巴細(xì)胞增殖情況；

m1——試驗(yàn)OD值；

m2——陰性對照OD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05顯著性差異，認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

由表1可知，3種非消化寡糖及其組合試驗(yàn)組與對照組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比較均有所提高，單一寡糖試驗(yàn)組脾臟指數(shù)為4.052～4.294，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，其中低聚木糖組效果最好，脾臟指數(shù)為4.294，與對照組相比提高了28.92%；復(fù)合寡糖試驗(yàn)組脾臟指數(shù)為4.554～4.814，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，其中低聚木糖與低聚半乳糖復(fù)合組效果最好，脾臟指數(shù)為4.814，與對照組相比提高了37.12%。

由表1可知，單一寡糖試驗(yàn)組小鼠胸腺指數(shù)為2.200～2.392，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，其中低聚木糖組效果最好，胸腺指數(shù)為2.392，與對照組相比提高了17.56%；復(fù)合寡糖灌胃組中小鼠胸腺指數(shù)為2.598～2.704，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，其中低聚木糖與低聚半乳糖復(fù)合組效果最好，胸腺指數(shù)為2.704，與對照組相比提高了27.07%。

以上數(shù)據(jù)分析表明，非消化性寡糖的攝入能促進(jìn)小鼠脾臟和胸腺的發(fā)育，可在一定程度上提高小鼠的免疫器官指數(shù)，說明非消化性寡糖的攝入能增強(qiáng)小鼠的免疫能力，且組合寡糖效果優(yōu)于單一寡糖，其中低聚木糖與低聚半乳糖組合效果最好，與王中華等[19]研究結(jié)果類似。

2.2 對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響

由圖1可知，單一寡糖試驗(yàn)組DTH反應(yīng)程度為0.005～0.008，單一寡糖組與對照組相比差異不顯著，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯差異；復(fù)合寡糖試驗(yàn)組為0.012～0.036，其中低聚木糖與低聚果糖復(fù)合組DTH反應(yīng)程度為0.023，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，低聚木糖與低聚半乳糖復(fù)合組DTH反應(yīng)程度為0.036，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，分別提高了86.95%，91.67%。結(jié)果表明，非消化性寡糖的攝入能提高小鼠機(jī)體細(xì)胞免疫能力，復(fù)合寡糖試驗(yàn)組的效果優(yōu)于單一寡糖試驗(yàn)組，其中低聚木糖與低聚半乳糖復(fù)合組效果最好。

表1 非消化寡糖對小鼠免疫器官指數(shù)的影響?

? **表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)

圖1 非消化寡糖對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響

Figure 1 Effect of NDOs on delayed allergic (DTH) in mice

2.3 對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

由圖2可知，單一寡糖試驗(yàn)組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力為4.674～6.016，其中低聚果糖與對照組相比不顯著，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯差異，低聚半乳糖組、低聚木糖組與對照組相比差異顯著(P<0.05)，分別提高了22.31%，24.69%；復(fù)合寡糖試驗(yàn)組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力為6.207～8.284，其中低聚木糖與低聚果糖復(fù)合組與對照組相比差異顯著(P<0.05)，低聚半乳糖與低聚果糖復(fù)合組、低聚木糖與低聚半乳糖復(fù)合組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，分別提高了28.95%，35.70%，43.58%。

**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)

圖2 非消化寡糖對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

Figure 2 Efects of NDOs on phagocytosis of mouse macrophages

結(jié)果表明，非消化性寡糖的攝入能提高小鼠機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫應(yīng)答能力，且復(fù)合寡糖試驗(yàn)組的效果優(yōu)于單一寡糖試驗(yàn)組，其中低聚木糖與低聚半乳糖組合效果最好。

2.4 非消化寡糖對小鼠血清溶血素的影響

由表2可知，單一寡糖試驗(yàn)組半數(shù)溶血值為45.436～48.676，其中低聚果糖組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯差異，其他單一寡糖試驗(yàn)組與對照組相比差異顯著(P<0.05)，低聚木糖組效果最好，半數(shù)溶血值為48.676，提高了6.65%；復(fù)合寡糖試驗(yàn)組半數(shù)溶血值為51.950～64.576，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，其中低聚木糖與低聚半乳糖復(fù)合組效果最好，半數(shù)溶血值為64.576，提高了29.64%。結(jié)果表明，非消化性寡糖的攝入能提高小鼠的體液免疫能力；復(fù)合寡糖試驗(yàn)組的效果優(yōu)于單一寡糖試驗(yàn)組，其中低聚木糖與低聚半乳糖復(fù)合組效果最好，與李梅等[20]研究結(jié)果相似。

表2 小鼠血清溶血素的測定結(jié)果?

? **表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

2.5 對小鼠淋巴細(xì)胞增殖情況的影響

由圖3可知，單一寡糖試驗(yàn)組SI值為0.994 0～1.214 6，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，其中低聚木糖組效果最好，SI值為1.214 0，提高了24.99%；復(fù)合寡糖試驗(yàn)組SI值為1.268 0～1.406 0，低聚半乳糖與低聚果糖復(fù)合組、低聚木糖與低聚果糖復(fù)合組與對照組相比差異顯著(P<0.05)，低聚木糖與低聚半乳糖復(fù)合組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，其中低聚木糖與低聚半乳糖復(fù)合效果最好，SI值為1.406 2，提高了35.23%。結(jié)果表明，非消化性寡糖的攝入能提高小鼠細(xì)胞免疫能力；復(fù)合寡糖試驗(yàn)組效果優(yōu)于單一寡糖試驗(yàn)組，其中低聚木糖與低聚半乳糖復(fù)合組效果最好，與李敬雙等[21]研究結(jié)果類似。

綜上試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合寡糖試驗(yàn)組效果優(yōu)于單一寡糖試驗(yàn)組，可能是在低聚木糖與低聚半乳糖被腸道益生菌代謝過程中產(chǎn)生了一些能促進(jìn)雙歧桿菌增殖的物質(zhì)，改善了小鼠腸道菌群環(huán)境，刺激了小鼠免疫系統(tǒng)，進(jìn)而增強(qiáng)了小鼠的免疫機(jī)能。

**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)

圖3 小鼠淋巴細(xì)胞增殖情況

Figure 3 Lymphocyte proliferation in mice

3 結(jié)論

通過測定不同免疫指標(biāo)，研究了低聚果糖、低聚木糖和低聚半乳糖3種非消化寡糖及其不同組合對小鼠免疫性能的影響。結(jié)果表明，非消化性寡糖的攝入能提高小鼠機(jī)體非特異性免疫能力；復(fù)合寡糖試驗(yàn)組提高小鼠機(jī)體非特異性免疫的能力優(yōu)于單一寡糖試驗(yàn)組，其中低聚木糖與低聚半乳糖(2∶3，質(zhì)量比)復(fù)合組效果最好。試驗(yàn)尚未對非消化寡糖的結(jié)構(gòu)以及復(fù)合寡糖的用量對增強(qiáng)小鼠機(jī)體非特異性免疫能力的原因進(jìn)行深入研究，后續(xù)將側(cè)重點(diǎn)于研究非消化寡糖的結(jié)構(gòu)以及復(fù)合寡糖的用量對小鼠非特異性免疫能力的影響。