周 奎，鄧連霞，杜瑤瑤，黃 偉

（杭州協(xié)合醫(yī)療用品有限公司，浙江 杭州 310018）

0 引言

透明質(zhì)酸（hyaluronicacid，HA），又稱玻尿酸，是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸通過糖苷鍵交替連接而成的大分子酸性粘多糖。透明質(zhì)酸多分布于哺乳動(dòng)物的結(jié)締組織和體液中，是構(gòu)成皮膚細(xì)胞間質(zhì)的成分，其通常以透明質(zhì)酸鈉鹽的形式存在[1-3]。透明質(zhì)酸主要是由動(dòng)物組織提取和微生物發(fā)酵兩種途徑制備得到[4-5]。HA分子中含有較多羥基和羧基，賦予了其很好的保濕性和清除自由基的功能，被廣泛用于化妝品中。但由于透明質(zhì)酸在組織間易被擴(kuò)散和降解，體內(nèi)存留時(shí)間短，難以充分發(fā)揮其物理化學(xué)特性，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的局限性。為了彌補(bǔ)這些缺陷，需要對(duì)透明質(zhì)酸進(jìn)行化學(xué)修飾或交聯(lián)，從而得到性能更優(yōu)異的透明質(zhì)酸衍生物。透明質(zhì)酸衍生物被應(yīng)用于微整形、組織填充、藥物緩釋、控釋載體等領(lǐng)域[6-10]。

為獲得充分、均勻的反應(yīng)體系，以二乙烯基砜為交聯(lián)劑，采用乳化法制備醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠微球，考察了乳化轉(zhuǎn)速、乳化時(shí)間、油水比、乳化劑濃度、透明質(zhì)酸鈉起始濃度等因素對(duì)凝膠微球粒徑的影響。在相對(duì)優(yōu)異的條件下，制備出粒徑均勻的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠微球，對(duì)其相關(guān)性能進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果符合《整形手術(shù)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠》（YY/T 0962-2014）要求。為工業(yè)化制備交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠微球提供一些數(shù)據(jù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑及儀器

透明質(zhì)酸鈉 （華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司）；二乙烯基砜（Sigma-Aldrich Co.LLC）；氫氧化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；span80（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；液體石蠟（江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司）；環(huán)己烷、無水乙醇（永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司）；AE500S-P實(shí)驗(yàn)室剪切乳化機(jī)；CV0100馬爾文流變儀；HG1697推拉力機(jī)；數(shù)顯顆粒圖像分析儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法[11-17]

（1）水相：稱取一定量透明質(zhì)酸鈉干粉于燒杯中，分多次加入1%氫氧化鈉溶液，攪拌1 h，至透明質(zhì)酸鈉溶解完全，透明，肉眼觀察無不溶解顆粒物。

（2）油相：稱取一定量的液體石蠟和span80，兩者按照一定比例稱取，攪拌均勻。

（3）將溶解后的透明質(zhì)酸鈉堿性凝膠轉(zhuǎn)移到油相燒杯中。設(shè)置好乳化轉(zhuǎn)速和時(shí)間，使用乳化機(jī)對(duì)油水混合相進(jìn)行乳化。

（4）乳化結(jié)束，向乳液中加入一定量的交聯(lián)劑二乙烯基砜，室溫?cái)嚢? h，于50℃下反應(yīng)2～4 h。交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束，待乳液冷卻，先后使用乙酸乙酯和無水乙醇對(duì)乳液進(jìn)行清洗處理，靜置分層，倒去上清液，除去殘留液體石蠟及span80。將得到的凝膠顆粒溶于磷酸鹽緩沖液中，溶脹過夜。倒去上清液，收集下層交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠微球，采用顯微計(jì)數(shù)法[14]統(tǒng)計(jì)微球的粒徑，每次計(jì)數(shù)不少于300粒。將凝膠微球灌裝于1.0 mL注射器中，進(jìn)行高壓蒸汽濕熱滅菌（121℃，15 min）。

1.3 性能檢測(cè)

1.3.1 粘彈性

取適量凝膠樣品，采用馬爾文流變儀進(jìn)行測(cè)定。在25℃下，在0.05～10 Hz范圍內(nèi)，繪制彈性模量G和粘性模量G〃的對(duì)數(shù)與頻率的對(duì)數(shù)坐標(biāo)圖，在1.0 Hz頻率下的粘性模量和彈性模量。

1.3.2 推擠力

將27G注射針安裝到注射器上，模擬實(shí)際使用情況。以20 mm/min恒定速度推動(dòng)推進(jìn)桿，注射器中的樣品經(jīng)由針頭被推擠出，得到推擠力曲線。由推擠力曲線可以看出樣品擠出過程中推擠力大小及樣品分散均勻情況。

1.3.3 溶脹度

稱取適量凝膠樣品，在105℃溫度下烘干至恒重，稱量恒重質(zhì)量m1。滴加純化水至溶脹完全后，用吸水紙吸取多余的水分，稱量溶脹后的質(zhì)量m2。溶脹度計(jì)算公式為

2 結(jié)果與討論

2.1 HA起始濃度對(duì)粒徑的影響

HA起始濃度是影響透明質(zhì)酸鈉乳化反應(yīng)效果的因素之一，不僅對(duì)交聯(lián)效果起重要作用，而且對(duì)凝膠微球的粒徑起關(guān)鍵作用。當(dāng)HA濃度低于1%時(shí)，透明質(zhì)酸鈉在乳液體系中很難形成有規(guī)則的凝膠。本節(jié)選用1%、3%、5%、8%、10%五個(gè)不同濃度，在固定其他參數(shù)的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比較不同HA起始濃度下制得的凝膠微球粒徑，如圖1。由圖1看出，當(dāng)HA起始濃度為8%時(shí)，所制備的凝膠顆粒平均粒徑為38.0μm。

Chart 1 The effect of HA initiation concentration on gel-particle size

2.2 乳化時(shí)間對(duì)粒徑的影響

在乳化過程中，分散相在高速乳化實(shí)驗(yàn)機(jī)外力的作用下，經(jīng)過一定時(shí)間才能形成均一粒徑、穩(wěn)定的乳液。為了得到預(yù)期粒徑的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠顆粒微球，需要對(duì)乳化時(shí)間進(jìn)行控制，在固定其他參數(shù)的條件下，以5 min為間隔，選取5～25 min間的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，乳化時(shí)間對(duì)粒徑的影響如圖2所示。從圖2可以看出，在固定其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)的條件下，不同乳化時(shí)間對(duì)凝膠粒徑的影響較大。當(dāng)乳化時(shí)間為20 min時(shí)，所得凝膠平均粒徑較小，粒徑為26.2μm。乳化時(shí)間過短，凝膠還未形成有效分散；乳化時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致乳液不穩(wěn)定，進(jìn)而導(dǎo)致乳液微滴的粘連。

2.3 油水比對(duì)粒徑的影響

Chart 2 The effect of emulsion time on gel-particle size

本節(jié)實(shí)驗(yàn)選取不同的油水比，在固定其他因素條件下，進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖3。凝膠微球的平均粒徑隨著油水比的增加而變小，兩者間呈現(xiàn)一定的關(guān)聯(lián)性，油水比越小，油相分散能力越強(qiáng)，所制備凝膠的平均粒徑越小。當(dāng)油水比為1/4時(shí)，凝膠微球平均粒徑為40.0μm。

Chart 3 The effect of oil/water ratio on gel-particle size

2.4 乳化劑濃度對(duì)粒徑的影響

乳化劑可以有效降低兩相界面的張力，促進(jìn)相互分散，有利于凝膠顆粒的形成。本實(shí)驗(yàn)選用span80作為乳化劑，在實(shí)驗(yàn)過程中，固定其他條件，針對(duì)乳化劑對(duì)凝膠粒徑的影響進(jìn)行研究。由圖4可以看出，在一定初始范圍內(nèi)，凝膠微球的平均粒徑隨著乳化劑濃度的增加而快速變小，當(dāng)乳化劑達(dá)到一定濃度后，凝膠微球平均粒徑基本不變。當(dāng)乳化劑濃度為1.5%時(shí)，凝膠微球平均粒徑為48μm。

Chart 4 The effect of emulsifier concentration on gel-particle size

2.5 乳化轉(zhuǎn)速對(duì)粒徑的影響

在乳化實(shí)驗(yàn)過程中，選用5個(gè)不同乳化轉(zhuǎn)速，固定其他反應(yīng)參數(shù)，得出如圖5結(jié)果。在特定乳化轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，凝膠微球的平均粒徑隨著乳化轉(zhuǎn)速的提高而變小。當(dāng)乳化轉(zhuǎn)速較低時(shí)，不能有效分散成乳液；增加轉(zhuǎn)速，剪切力增大，乳液不易沉降，從而形成均勻粒徑的凝膠微球。當(dāng)乳化轉(zhuǎn)速為2500 r/min時(shí)，凝膠微球平均粒徑達(dá)到56 μm。

Chart 5 The effect of stirring speed on gel-particle size

2.6 性能檢測(cè)[18-21]

在各因素設(shè)定為較佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)下（透明質(zhì)酸鈉起始濃度為8%、油水比為1/4、乳化劑濃度為5%、乳化轉(zhuǎn)速為2500 r/min、乳化時(shí)間為20 min）制備交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠微球，對(duì)其主要性能進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表1、圖6～圖8。

Diagram 1 performance test

Chart 6 gel-particle size distributions

Chart 7 push force of the gel

Chart 8 Viscoelasticity of the gel

3 結(jié)論

通過乳化法制備醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠微球，對(duì)HA起始濃度、乳化轉(zhuǎn)速、乳化時(shí)間、乳化劑濃度及油水相比等參數(shù)進(jìn)行初步研究，并對(duì)參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整和優(yōu)化，在較為理想的乳化條件下制備出符合性能要求的醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠微球。所制備的醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠微球樣品性能穩(wěn)定，粘彈性較低、推擠力較小且平穩(wěn)。在面部整形手術(shù)中，可以得到很好的效果。本方法工藝簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)過程易于控制，反應(yīng)條件溫和，解決了交聯(lián)反應(yīng)不均勻的問題。該方法可以進(jìn)行快速放大生產(chǎn)，便于工業(yè)化生產(chǎn)，所制備的醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠微球具有良好的應(yīng)用價(jià)值。