崔 雙,唐禹馨,侯海靜
(1.舟山醫(yī)院婦產(chǎn)科,浙江 舟山 316000;2.舟山婦幼保健院產(chǎn)科,浙江 舟山 316000)
妊娠丟失(pregnancy loss,PL)可出現(xiàn)在整個(gè)妊娠期間,其中胚胎開始發(fā)育的妊娠早期較為常見。早期妊娠丟失(early pregnancy loss,EPL)是指妊娠12周以前的妊娠丟失,包括流產(chǎn)和生化妊娠丟失[1]。結(jié)合我國相關(guān)研究,EPL在妊娠丟失中約占80%,最常見的有自發(fā)性流產(chǎn),胚胎停育,胎死宮內(nèi)等情況[2]。復(fù)發(fā)性EPL由于其病因復(fù)雜、預(yù)后較差和對孕婦身心健康的不良影響,一直受到學(xué)界關(guān)注。葉酸(即維生素B9)是一種水溶性的維生素,對促進(jìn)胎兒神經(jīng)細(xì)胞分化、預(yù)防胎兒的神經(jīng)管畸形有重要作用。然而葉酸需要進(jìn)行多重酶的催化作用才能產(chǎn)生活性,其中亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成還原酶(MTRR)等屬于關(guān)鍵酶,其基因位點(diǎn)的多態(tài)性易造成酶活性降低而導(dǎo)致葉酸代謝障礙,引發(fā)相關(guān)疾病[3]。有研究指出,部分婦女產(chǎn)生不良孕產(chǎn)結(jié)局與葉酸代謝相關(guān)酶基因多態(tài)性有關(guān)[4]。葉酸多聚谷氨酸是人體通過飲食而攝取的葉酸,需要在空腸中水解為葉酸單聚谷氨酸才能進(jìn)入血液。我國地域遼闊,南北飲食差異巨大,而且機(jī)體對于葉酸的吸收代謝能力因人而異,所以人體葉酸代謝基因多態(tài)性也具有較大差異[5]。目前對于葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性與不良妊娠結(jié)局的研究較多,但鮮見對復(fù)發(fā)性EPL的專門研究。本文旨在研究復(fù)發(fā)性EPL與葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性的關(guān)系,為我國妊娠婦女的相關(guān)臨床研究提供依據(jù)。
選取2016年4月至2018年4月在舟山醫(yī)院和舟山婦幼保健院婦產(chǎn)科就診的170例孕婦為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡為20~35周歲,民族不限;②臨床診斷為復(fù)發(fā)性EPL,指妊娠婦女在孕12周之前出現(xiàn)2次及以上的流產(chǎn)[6];③了解研究內(nèi)容并自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①有吸煙史、酗酒史;②患有腫瘤者或者其他嚴(yán)重的循環(huán)、血液等系統(tǒng)疾??;③合并子宮畸形、宮頸功能不全、染色體異常、妊娠期并發(fā)癥或已知胎兒畸形。符合入組標(biāo)準(zhǔn)的復(fù)發(fā)性EPL孕婦84例為研究組,選取正常分娩或者是妊娠結(jié)局正常的孕婦86例為對照組,兩組的年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、民族、孕次、產(chǎn)次比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見表1。
表1 兩組人口學(xué)及病情資料比較結(jié)果
1.2.1收集研究對象信息
成立復(fù)發(fā)性EPL與葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性研究的團(tuán)隊(duì),團(tuán)隊(duì)成員進(jìn)行統(tǒng)一的培訓(xùn),培訓(xùn)合格后方可開展本項(xiàng)研究。培訓(xùn)的主要內(nèi)容包括:妊娠婦女肘靜脈血采樣方法,數(shù)據(jù)的采集、錄入、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。收集信息內(nèi)容包括:①研究對象的一般情況資料,如年齡、BMI、民族等;②妊娠婦女孕期情況、孕產(chǎn)史、家族史等。
1.2.2采集DNA的方法
由專業(yè)團(tuán)隊(duì)成員采樣妊娠婦女肘晨間空腹靜脈血4mL,利用PCR-熒光探針試劑盒抽提研究對象樣本的DNA。
1.2.3檢測方法
運(yùn)用PCR和熒光法進(jìn)行亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因的C677T、A1298C位點(diǎn)、甲硫氨酸合成還原酶(MTRR)基因的A66G位點(diǎn)的SNP分型。Taqman-MGB探針?biāo)诘奈恢靡姳?。PCR每個(gè)反應(yīng)體系為10μL總體積,包含20ng/μL×1μL的DNA模板、5μL的2×Taqman Universal Master Mix,0.5μL的20×Taqman-MGB探針和3.5μL去離子水。PCR反應(yīng)條件為95℃ 10min,第一步在92℃ 15s、60℃ 1min條件下進(jìn)行20個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增,第二步在89℃ 15s,60℃ 90s條件下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后,在ABI熒光PCR儀器(ABI 7900型,美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn))上讀取樣品孔中的終點(diǎn)熒光,利用配套的分析軟件計(jì)算各個(gè)樣本的基因分型結(jié)果。
表2 Taqman-MGB探針位置
兩組MTHFR基因C677T中CC型、CT型和TT型分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.212,P=0.027),見表3。
表3 兩組MTHFR基因C677T分布的比較結(jié)果[n(%)]
兩組MTHFR基因A1298C中AA型、AC型、CC型分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.458,P=0.038),見表4。
表4 兩組MTHFR基因A1298C比較結(jié)果[n(%)]
兩組MTRR基因A66G中AA型、AG型、CG型分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.093,P=0.029),見表5。
表5 研究組與對照組MTRR基因A66G比較結(jié)果[n(%)]
復(fù)發(fā)性妊娠丟失是指孕婦發(fā)生自發(fā)性流產(chǎn)、胚胎的停育、胎死宮內(nèi)的情況連續(xù)發(fā)生兩次或者兩次以上[6]。引起妊娠婦女復(fù)發(fā)性EPL的原因與多種因素有關(guān),主要包括:染色體異常、遺傳相關(guān)因素、妊娠婦女內(nèi)分泌及免疫功能紊亂等。妊娠丟失后再次妊娠的成功率僅為37%,胎死宮內(nèi)的發(fā)生率為32%,婦女出現(xiàn)自然流產(chǎn)的發(fā)生率也達(dá)到28%[7]。相關(guān)流行病學(xué)研究顯示,妊娠丟失的患者中37%~44%具有較為明確的原因,大部分妊娠丟失的原因尚無法解釋[8]。復(fù)發(fā)性EPL是早期妊娠不良結(jié)局中最為常見的一種,并且引發(fā)其產(chǎn)生的原因較多、較為復(fù)雜,如:染色體的異常、妊娠婦女合并有全身性的疾病、感染因素、內(nèi)分泌因素、妊娠早期接受腹部手術(shù)、胎兒附屬物(胎盤、臍帶)等因素[9]。我國復(fù)發(fā)性EPL的發(fā)生率呈上升的趨勢,值得醫(yī)護(hù)人員的關(guān)注。
葉酸是妊娠婦女體內(nèi)極其重要、不能缺少的營養(yǎng)物質(zhì),其具有極其重要的生理作用,包括DNA的合成、甲基化、人體生長發(fā)育、基因表達(dá)等多個(gè)方面。同時(shí)葉酸對胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有重要作用,相關(guān)代謝基因與妊娠婦女子癇前期、胎盤早剝及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局具有高度相關(guān)性[10]。妊娠婦女對葉酸的需求是普通人對葉酸需求的4倍,人體內(nèi)眾多酶系與葉酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝有關(guān),而其中葉酸代謝的關(guān)鍵酶是MTHFR和MTRR兩種。關(guān)鍵酶的基因在不同的國家、地區(qū)的人群中具有多態(tài)性[11]。當(dāng)其發(fā)生突變時(shí),會(huì)使酶的活性發(fā)生相應(yīng)的改變,從而導(dǎo)致葉酸的代謝發(fā)生改變,并導(dǎo)致活性葉酸在妊娠婦女的體內(nèi)水平異常。妊娠婦女MTHFR基因最為重要,在人體染色體上可以編碼氨基酸的數(shù)量為656個(gè),位置是1p36.3,一共包括了外顯子11個(gè),內(nèi)含子10個(gè)。MTHFR基因編碼的蛋白質(zhì)可以對5,10-亞甲基四氫葉酸為5-甲基四氫葉酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化。近年的研究發(fā)現(xiàn),MTHFR基因發(fā)生的多態(tài)性突變位點(diǎn)已經(jīng)達(dá)到了近20種,其中最為重要的突變位點(diǎn)是C677T位點(diǎn)及A1298C這兩個(gè)位點(diǎn)[12]。C677T多態(tài)性突變后,表現(xiàn)的基因型有3種,分別為:CC型、CT型及TT型。A1298C多態(tài)性突變后,表現(xiàn)的基因型有3種,分別為:AA型、AC型及CC型。MTRR基因的A66G多態(tài)性突變后,表現(xiàn)的基因型有3種,分別為:AA型、AG型和GG型[13]。
本研究結(jié)果表明研究組MTHFR基因C677T位點(diǎn)的CC型、CT型和TT型基因分布,A1298C位點(diǎn)的AA型、AC型、CC型基因分布和MTRR基因A66G位點(diǎn)的AA型、AG型、CG型基因分布均高于對照組,這與國內(nèi)的相關(guān)研究結(jié)果相似[14-15],其中研究組的TT型、CC型和CG型分布均高于既往報(bào)道,提示該3種基因型的表達(dá)可能與妊娠丟失反復(fù)發(fā)作有一定關(guān)聯(lián),但這需要未來進(jìn)一步研究證實(shí)。
綜上所述,復(fù)發(fā)性EPL與葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性具有相關(guān)性,對于有高危基因型突變的妊娠婦女應(yīng)盡早、及時(shí)地進(jìn)行干預(yù),減少復(fù)發(fā)性EPL的發(fā)生。