范延艮，趙秀秀，王翰悅，田月月，向勤锃，張麗霞

黃金芽不同色澤葉片生理特性研究

范延艮，趙秀秀，王翰悅，田月月，向勤锃，張麗霞*

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018

為篩選用于黃金芽葉色黃化分子機(jī)理研究的適宜材料，采用雙層遮蔭（平均光強(qiáng)約10?klx）、單層遮蔭（平均光強(qiáng)約40?klx）和不遮蔭3種光照強(qiáng)度處理黃金芽春梢，獲得嫩綠色（H1W）、淺黃稍帶綠色（H4W）、明黃色（Hs）3種新梢，同時以福鼎大白綠色新梢（CKf）為對照，選擇芽下第二葉為材料，通過測定H2O2、O2-含量和組織化學(xué)定位、抗氧化物酶活性、光合響應(yīng)曲線、葉綠素?zé)晒獾热~片生理指標(biāo)，觀測葉綠體膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，淺黃稍帶綠葉片H4W的H2O2、O2-含量、值和葉綠體膜系統(tǒng)情況與嫩綠色葉片H1W相近，處于未受逆境脅迫的生理狀態(tài)；同時淺黃葉片H4W與明黃葉片Hs具有相似的黃化葉光合生理特性，兩者在、、光飽和點(diǎn)、光補(bǔ)償點(diǎn)等葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合指標(biāo)上差異不顯著，光響應(yīng)曲線特征相似。由于淺黃稍帶綠葉片（H4W）所具有的上述生理特點(diǎn)，推測其是探究黃金芽茶樹品種黃化分子機(jī)理必不可少的研究材料。

黃金芽；光氧化脅迫；光照強(qiáng)度；黃化材料

黃金芽屬于光照敏感型葉色突變茶樹品種，已有研究表明，黃金芽的葉色受光照強(qiáng)度調(diào)控，光照強(qiáng)度為11~15?klx的時候開始黃化，高于60?klx可能導(dǎo)致葉片灼傷，而適當(dāng)?shù)恼谑a處理可使黃化葉片復(fù)綠[1]。目前，人們以黃金芽自然光下的黃化葉與遮蔭復(fù)綠葉為材料，運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等現(xiàn)代分子生物學(xué)方法探究其黃化的分子機(jī)理，并取得了良好進(jìn)展。但也出現(xiàn)了一些研究結(jié)果不一致的現(xiàn)象，如：Song等[2]對自然光與遮蔭45%處理的黃金芽新梢芽下第三葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自然光下黃化葉的類胡蘿卜素途徑基因抑制表達(dá)；而Li等[3]對遮蔭度45%、60%以及自然光下的黃金芽一芽二葉材料的研究結(jié)果表明：自然光下黃化葉的類胡蘿卜素途徑基因表達(dá)是上調(diào)的。Zhang等[4]通過對自然光與60%遮蔭度處理的黃金芽一芽二葉進(jìn)行代謝組分析發(fā)現(xiàn)，黃化葉片中的總類黃酮含量顯著下降，低于遮蔭復(fù)綠葉；而Li等[3]的研究結(jié)果則表明：自然光下的黃化葉片中總多酚類含量顯著高于60%左右遮蔭度的復(fù)綠葉片。上述迥異的研究結(jié)果可能與試驗所取材料的生理狀態(tài)不同有關(guān)。雖然上述研究材料黃化葉均來源于自然光處理，但不同地區(qū)、季節(jié)等諸多因素均會影響自然光照強(qiáng)度，從而導(dǎo)致黃化葉片生理狀態(tài)的不同。

眾所周知，植物在脅迫狀態(tài)下，代謝水平和基因表達(dá)會發(fā)生巨大變化，如果不能正確區(qū)分脅迫與非脅迫狀態(tài)的研究材料，則會對研究結(jié)果產(chǎn)生偏差。黃金芽作為一種光照敏感型黃化茶樹品種，目前對于不同光強(qiáng)條件下葉片的生理狀態(tài)尚未被關(guān)注。為了篩選用于黃金芽的黃化分子機(jī)理研究的試驗材料，本研究以四年生黃金芽茶樹為材料，設(shè)置不同光強(qiáng)處理，獲得嫩綠、淺黃和明黃3種不同色澤的葉片，同時設(shè)置自然光下的福鼎大白芽下第二葉作為對照，通過測定活性氧、抗氧化酶、葉綠素?zé)晒鈪?shù)等生理生化指標(biāo)，探究不同光強(qiáng)下黃金芽葉片的生理特性，并為闡明黃金芽受光調(diào)控葉色的機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年4月茶樹第一輪新梢萌發(fā)后，以4年生黃金芽無性系茶樹品種為試驗材料，以雙層6針遮蔭網(wǎng)（平均光照強(qiáng)度約10?klx，編號H1W）、單層6針遮蔭網(wǎng)（平均光照強(qiáng)度約40?klx，編號H4W）以及自然光（平均光照強(qiáng)度約90?klx，編號HS）處理黃金芽茶樹7?d，獲得不同葉色的新梢，其芽下第二葉的葉色分別為嫩綠（H1W）、淺黃稍帶綠（H4W）、明黃（HS）。取上述不同葉色材料進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)測定，每個指標(biāo)測定3個樣品，取平均值。同時，以福鼎大白茶樹品種（非葉色突變體）不遮蔭處理為參照樣（CKf，深綠色），以便分析黃金芽這一葉色突變體的生理特性。不同光照強(qiáng)度下的葉片顏色見圖1。

1.2 試驗方法

1.2.1 過氧化氫含量測定及組織化學(xué)染色

過氧化氫（H2O2）含量按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的過氧化氫試劑盒（貨號：A064-1）說明書測定。

H2O2的組織化學(xué)染色參考文獻(xiàn)[5]的方法，略有修改。取新鮮葉片（芽下第二葉）用蒸餾水洗凈后，放入1?mg·mL-1DAB反應(yīng)液中（pH=3.8，50?mmol·L-1Tris-HCl），抽真空使葉片完全浸沒，28℃避光保存14?h，然后用90%乙醇70℃水浴進(jìn)行脫色，直至葉片完全脫綠后進(jìn)行拍照。

1.2.2 超氧陰離子含量測定及組織化學(xué)染色

超氧陰離子（O2-）產(chǎn)生速率的測定參照王愛國等[6]的羥胺氧化法。O2-組織化學(xué)染色參考Jabs等[7]的方法，略作修改。取芽下第二葉用蒸餾水洗凈后，放入0.5?mg·mL-1NBT反應(yīng)液中（pH=7.8，10?mmol·L-1磷酸鉀緩沖液），抽真空使葉片完全浸沒，將其在室溫黑暗條件下放置1?h，然后用90%乙醇70℃水浴進(jìn)行脫色，直至葉片完全脫綠后進(jìn)行拍照。

1.2.3 抗氧化系統(tǒng)酶活性測定

用氮藍(lán)四唑（NBT）還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，以抑制光化還原50%為1個酶活性單位；用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性；過氧化氫酶（CAT）活性的測定參照Chance等[8]的方法。

1.2.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

將茶樹芽下第二片葉片暗處理30?min，采用英國Hansatech公司生產(chǎn)的FMS-2型調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x測定暗適應(yīng)下最大熒光（F）、可變熒光（F）和初始熒光（F），獲得最大光化學(xué)效率（）、實際光化學(xué)效率（）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（）和電子傳遞速率（）。

1.2.5 光響應(yīng)曲線測定

用Ciras-3型光合儀（PP-Systems公司，美國）測定不同光照強(qiáng)度處理下葉片的光響應(yīng)曲線，測定參數(shù)由儀器的可調(diào)光源、外置式CO2供氣系統(tǒng)和溫度監(jiān)控裝置控制，通過光合計算器4.1.1（http://www.pengli.org.cn）計算模擬光響應(yīng)曲線。

1.2.6 葉綠體膜系統(tǒng)觀測

葉綠體超微機(jī)構(gòu)觀測參照Li等[3]方法，芽下第二葉避開葉脈取1~2?mm2大小葉片，4℃下用2.5%（︰）戊二醛固定過夜，然后用1%（︰）OsO4固定2?h，之后用30%~100%的梯度乙醇對固定樣品進(jìn)行脫水，最后用樹脂固定，在超薄切片機(jī)上切片，用堿性檸檬酸鉛和醋酸鈾酰染色，在1400Plus透射電鏡（JEM，日本）中觀察葉綠體超微結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用SPSS 19.0軟件通過單因素方差分析（One-way ANOVA）中的Duncan檢驗進(jìn)行顯著性差異分析（=0.05），利用GraphPadPrism 5.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同色澤葉片的氧化還原狀態(tài)

從黃金芽不同色澤葉片和對照葉片中O2-和H2O2含量測定結(jié)果可知（圖2-A），葉片中H2O2含量依次為H1W＜H4W＜HS＜CKf，其中H1W與H4W、HS與CKf之間的差異不顯著，但H1W、H4W與HS、CKf之間的含量差異卻十分顯著。由此，可根據(jù)葉片中H2O2含量的高低將4個樣品分成以下兩組：第Ⅰ組為低H2O2含量組，包括H1W和H4W；第Ⅱ組為高H2O2含量組，包括HS和CKf。不同樣品葉片中O2-含量高低情況與H2O2相似，也依次為H1W＜H4W＜HS＜CKf，但各樣品之間的O2-含量差異均達(dá)到顯著水平，其中H4W、HS和CKf的O2-含量分別是H1W的1.17、2.28倍和2.83倍。同時，從圖2-A可以看出，4個樣品也可根據(jù)O2-含量分成差異顯著的高、低兩組，并與H2O2的分組情況一致。此外，O2-和H2O2的含量測定結(jié)果與葉片的組織定位結(jié)果完全一致（圖2-B）。

對黃金芽不同色澤葉片和福鼎大白葉片中3種抗氧化酶活性的測定結(jié)果見表1。由表1可知，清除O2-的SOD活性依次為CKf>H1W>Hs>H4W，但CKf與H1W，H1W與Hs之間的酶活性不存在顯著差異。分解H2O2的POD活性以葉片H4W最高，分解H2O2并同時釋放O2的CAT活性以H1W最低，它們分別與其他3個樣品的酶活性差異達(dá)到了顯著水平。

2.2 不同色澤葉片的葉綠素?zé)晒馀c光合參數(shù)

葉綠素?zé)晒鈪?shù)值常用于葉片光合生理狀態(tài)的判定。目前普遍認(rèn)為，當(dāng)值在0.80~0.85時，絕大多數(shù)高等植物處于健康生理狀態(tài)；當(dāng)下降時，表明植物受到了脅迫[9]。從表2可知，葉片H1W和H4W的值相近，且均大于0.82，而葉片Hs和CKf的值分別為0.67、0.70。由此推斷，黃金芽的嫩綠色葉片H1W、淺黃色稍帶綠葉片H4W均未受到光抑制或其他逆境的脅迫，但黃金芽的明黃色葉片Hs和對照CKf均受到了光抑制或其他逆境的脅迫，如：O2-和H2O2含量過高導(dǎo)致的氧化脅迫。

注：H1W：雙層6針遮蔭網(wǎng)下的黃金芽嫩綠色葉片；H4W：單層6針遮蔭網(wǎng)下的黃金芽淺黃色葉片；HS：自然光下的黃金芽明黃色葉片；CKf：自然光下的福鼎大白葉片，下同

注：A：H2O2與O2-含量；B：O2-和H2O2的組織化學(xué)定位

Fig. 2Oxidative and antioxidant status of leaves under different leaf colors

表1 不同色澤葉片的抗氧化酶活性

注：‘**’即<0.01。同列不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）

Note: ‘**’ means<0.01. Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatments at 0.05 level

葉綠素?zé)晒鈪?shù)、和分別反映了實際光化學(xué)效率、光化學(xué)淬滅和光合電子傳遞速率情況。從表2可知，黃金芽不同色澤葉片的、和均顯著低于對照CKf，其中H1W的、僅約為對照CKf的1/2。此外，黃金芽兩種黃化葉片H4W和Hs的、顯著高于嫩綠葉片H1W，但H4W與Hs之間的差異不顯著；以H4W最高，Hs最低，且3個樣品之間差異顯著。

通過對比黃金芽不同色澤葉片光合參數(shù)發(fā)現(xiàn)（圖3，表3），最大凈光合速率M、表觀光量子效率AQE、暗呼吸速率DRR均呈現(xiàn)為H1W>H4W>Hs，與葉片黃化程度成反比；而光飽和點(diǎn)Lsp、光補(bǔ)償點(diǎn)Lcp則為H1W＜H4W＜Hs，與葉片黃化程度呈正相關(guān)。除DRR和Lcp外，黃金芽葉片的光合參數(shù)M、AQE和Lsp值均低于福鼎大白CKf。各樣品之間的胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和葉溫隨光照強(qiáng)度變化的趨勢相同，其中，Ci以H4W最大，Gs以Hs最大，葉溫以CKf最高且顯著高于黃金芽的3個樣品（圖3）。

表2 不同色澤葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

Table 2 Determination of chlorophyll fluorescence parameters of leaves with different colors

注：‘**’即<0.01。同列不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）

Note: ‘**’ means<0.01. Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatments at 0.05 level

注：A為凈光合速率；B為胞間CO2濃度；C為氣孔導(dǎo)度；D為葉溫

2.3 不同色澤葉片的葉綠體膜系統(tǒng)生理狀態(tài)

從圖4可知，與對照CKf相比，黃金芽的葉綠體膜系統(tǒng)缺乏清晰的基粒片層結(jié)構(gòu)，這是該品種葉綠體膜系統(tǒng)的顯著特征。同時，不同葉色的葉綠體在類囊體結(jié)構(gòu)上也存在較大差異。明黃葉片Hs的類囊體結(jié)構(gòu)模糊，有囊泡；嫩綠色葉片H1W類囊體結(jié)構(gòu)清晰；淺黃稍帶綠葉片H4W的類囊體結(jié)構(gòu)總體上與H1W較相似，但清晰度稍有下降。

3 討論與結(jié)論

黃金芽作為一種光照敏感型黃化茶樹品種，其葉片會隨著環(huán)境光照強(qiáng)度由低到高依次呈現(xiàn)“深綠→綠→黃綠→黃→金黃→黃白”[10]等多種色澤。本研究采用3種光照強(qiáng)度（自然光和2種遮蔭覆蓋）處理黃金芽茶樹，獲得了嫩綠、淺黃稍帶綠和明黃3種色澤的新梢，并選取芽下第二葉進(jìn)行了氧化還原狀態(tài)、抗氧化酶、葉綠素?zé)晒?、光合作用等生理指?biāo)的測定以及葉綠體膜系統(tǒng)觀測，同時通過與自然光下福鼎大白芽下第二葉相關(guān)結(jié)果進(jìn)行對比分析，得出以下結(jié)論：

（1）黃金芽不同色澤葉片生理狀態(tài)不同。其中，嫩綠色葉片H1W與明黃色葉片Hs之間，除SOD、POD酶活性外，其余所測指標(biāo)均差異顯著。淺黃稍帶綠色葉片H4W的生理指標(biāo)值大都居于H1W和Hs之間，其中一些指標(biāo)值會偏向H1W或Hs。如：H4W與H1W的O2-、H2O2含量均低，值相近（0.82、0.83），的值在植物受到脅迫時會顯著下降[11]，前人研究同樣發(fā)現(xiàn)55%遮蔭度的黃金芽葉片與70%和85%遮蔭度的黃金芽葉片值無顯著差異，而與自然光下的葉片差異顯著[9]。此外，本研究中H4w與H1w的葉綠體的膜系統(tǒng)也無顯著差異，以上結(jié)果表明兩者同處于無脅迫的生理狀態(tài)；而H4w與Hs在、、光合響應(yīng)曲線特征、光飽和點(diǎn)、光補(bǔ)償點(diǎn)等指標(biāo)上差異不顯著，兩者具有相似的光合生理特性。綜上所述，黃金芽淺黃色葉片H4W既具有明黃色葉片Hs的黃化生理特征，同時又處于與H1W相似的無逆境脅迫生理狀態(tài)，相較于前人對黃金芽黃化機(jī)理研究采用自然光下的黃化材料和遮蔭后的復(fù)綠材料[2-4]，H4W能較好地體現(xiàn)黃金芽品種的生理特性，是探究黃金芽茶樹品種黃化分子機(jī)理必不可少的研究材料。

表3 不同色澤葉片的光合參數(shù)比較

Table 3 Comparison of photosynthetic parameters of different colorleaves

注：M：最大凈光合速率；AQE：表觀光量子效率；DRR：暗呼吸速率；Lsp：光飽和點(diǎn)；Lcp：光補(bǔ)償點(diǎn)

Note: M: Maximumnet photosynthetic rate. AQE: Apparent Quantum Efficiency. DRR: Dark respiration rate. Lsp: Light saturation point. Lcp: Light compensation point

圖4 不同葉色狀態(tài)下的葉綠體結(jié)構(gòu)

（2）與福鼎大白對照品種相比，黃金芽茶樹品種具有以下光合生理特點(diǎn)：①光飽和點(diǎn)Lsp低、光補(bǔ)償點(diǎn)Lcp高，表現(xiàn)出對光強(qiáng)變化的敏感性。②和光合電子傳遞能力較弱，其實際光化學(xué)效率、光化學(xué)淬滅和光合電子傳遞速率顯著低于福鼎大白；③光合作用較弱，最大凈光合速率M、表觀光量子效率AQE低于福鼎大白。④具有獨(dú)特的葉綠體膜系統(tǒng)，其典型特征是缺乏清晰的基粒片層[3]。結(jié)合本研究葉片O2-和H2O2含量測定和組織定位分析、葉溫、葉綠素?zé)晒獾葴y定結(jié)果以及有關(guān)主要存在部位的報導(dǎo)進(jìn)行綜合分析，推測黃金芽葉綠體基粒片層的缺失與氧化和葉溫等逆境脅迫無關(guān)，而與或光合電子傳遞鏈密切相關(guān)。

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Study on Physiological Characteristics of Leaves with Different Colors of ‘Huangjinya’

FAN Yangen, ZHAO Xiuxiu, WANG Hanyue, TIAN Yueyue, XIANG Qinzeng, ZHANG Lixia*

Shandong Agricultural University, Tai'an 271017, China

In order to screen suitable materials for studying the molecular mechanism of ‘Huangjinya’, the spring shoots of ‘Huangjinya’ were treated with double shading (average light intensity of 10?klx), single shading (average light intensity of 40?klx) and non-shading. And three new shoots, light green (H1W), light yellow (H4W) and bright yellow (Hs), were obtained. At the same time, the second leaf under bud was selected as material with ‘Fudingdabai’ green shoot (CKf) as control. The content of hydrogen peroxide, oxygen-and histochemical localization, antioxidant enzyme activity, photosynthetic response curve, chlorophyll fluorescence and other physiological indicators of leaves were measured and the structure of chloroplast membrane system was observed. The results show that The H2O2, O2-contents,value and chloroplast membrane system of light yellow leaf H4Wwere similar to those of light green leaf H1W, which were in a stress-free state. At the same time, the photosynthetic and physiological characteristics of light yellow leaf H4Wand bright yellow leaf Hs were similar. There were no significant differences in chlorophyll fluorescence parameters and photosynthetic indexes such as,, light saturation point and light compensation point, and the characteristics of light response curve were similar. Because of the above physiological characteristics of light yellow leaf H4W, it could be used as the research material to explore the molecular mechanism of yellowing of golden bud tea varieties.

cv. Huangjinya, photooxidation stress, light-intensity, chlorotic material

S571.1；Q945

A

1000-369X(2019)05-530-07

2019-03-13

2019-05-01

山東“雙一流”獎補(bǔ)資金（515563001）

范延艮，男，博士研究生，主要研究方向為茶樹生理與生態(tài)，876562801@qq.com。*通信作者：zlx_sdau@163.com