黃丹娟，譚榮榮，陳勛，王紅娟，龔自明，王友平，毛迎新*

鋁誘導(dǎo)的茶樹根系轉(zhuǎn)錄組變化分析

黃丹娟1，譚榮榮1，陳勛1，王紅娟1，龔自明1，王友平2，毛迎新1*

1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所，湖北 武漢 430064；2. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所，湖北 武漢 430064

探討茶樹響應(yīng)鋁（Aluminum，Al）的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和表達模式，確定一些關(guān)鍵候選基因，為茶樹耐Al分子機制研究奠定基礎(chǔ)。測定了0、0.2、1、2、4?mmol·L-15個Al3+濃度處理7?d的福鼎大白茶根系抗氧化酶活性和Al含量變化，并提取0?mmol·L-1（R0）、1?mmol·L-1（R1）和4?mmol·L-1（R4）3個濃度下的茶樹根系總RNA，通過Illumina Hiseq Xten平臺進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果表明，隨著Al3+濃度的升高，根系POD（Peroxidase，過氧化物酶）活性逐漸下降，APX（Ascorbic acid peroxidase，抗壞血酸過氧化物酶）活性則逐漸升高。SOD（Superoxide dismutase，超氧化物歧化酶）活性在Al3+濃度為1?mmol·L-1時最高，CAT（Catalase，過氧化氫酶）活性在各處理間無顯著差異。根系中Al含量隨著Al3+濃度的升高呈先上升后下降趨勢，在Al3+濃度為1?mmol·L-1時達到最高。經(jīng)篩選得到R1 VS R0，R4 VS R0，R4 VS R1的DEGs（Differentially expressed genes）分別為1?894、2?439個和1?384個，顯著上調(diào)（下調(diào)）的差異表達基因分別有733（1?161）、846（1?593）個和628（756）個。GO富集分析表明，3個處理組在生物學(xué)途徑中富集最多的類別均為刺激響應(yīng)。在分子功能和細胞組件方面，R1 VS R0和R4 VS R0富集最多的類別均為核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性和細胞外圍，R4 VS R1富集最多的類別為氧化還原酶活性相關(guān)基因和膜區(qū)域。KEGG富集分析表明，R1 VS R0、R4 VS R0、R4 VS R1分別顯著富集了29、41條和19條Pathway，它們包括轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運蛋白、植物-病原菌互作、苯丙烷生物合成途徑等，鑒定到多個參與調(diào)控活性氧代謝、有機酸或金屬轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子及細胞壁結(jié)構(gòu)修飾等生理過程的基因在Al誘導(dǎo)后上調(diào)或抑制表達，顯示這些基因與茶樹耐Al分子機制密切相關(guān)。

茶樹；Al；根系；差異表達基因；RNA測序

在中性或中等酸性土壤中，Al主要以不溶性沉積物的形式存在。但在酸性土壤（pH<5.0）中，Al以Al3+、Al(OH)2+和Al(OH)2+等形式被溶解釋放到土壤溶液，從而抑制根系的生長，減少水分和養(yǎng)分的吸收，導(dǎo)致作物減產(chǎn)[1]。因此，Al毒是酸性土壤中作物產(chǎn)量的主要限制因素。茶樹適宜生長在pH為4.5~5.5的酸性土壤中，作為一種Al超富集植物，其體內(nèi)Al含量是其他植物的幾十到幾百倍，且不表現(xiàn)毒害癥狀，適宜濃度的Al能明顯促進茶樹生長[2-3]。

茶樹的耐Al機制可分為外部排斥和內(nèi)部耐受兩種方式。首先，茶樹根系可以分泌草酸、檸檬酸、蘋果酸等低分子量有機酸，螯合過量的Al3+，進而減少與根表皮細胞壁和質(zhì)膜上結(jié)合的Al3+數(shù)量[4-7]。其次，進入茶樹體內(nèi)的Al約70%沉積在細胞壁，并且根部細胞壁中73%的Al與果膠和半纖維素結(jié)合[8-9]。而進入原生質(zhì)體中的Al有80%區(qū)隔化在液泡中，其余的以Al-兒茶素、AI-F、Al-草酸、Al-磷酸鹽等穩(wěn)定絡(luò)合物貯存[10]。同時，從過量Al3+引起的損害中恢復(fù)則依靠的是對活性氧（ROS，reactive oxygen species）毒害的解除作用。過量Al3+引起植物代謝變化，產(chǎn)生的活性氧對生長組織造成損害，這種損傷誘導(dǎo)編碼清除ROS酶（如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶等）的基因轉(zhuǎn)錄，這些基因的過表達增強了植物對Al的耐受性[11]。以往對茶樹耐Al機理的研究大多集中于生理生化層面，植物耐Al分子機理的研究主要集中在擬南芥[12-13]、水稻[14]、蕎麥[15]、繡球花[16]等植物中，大量與Al響應(yīng)相關(guān)候選基因被挖掘與鑒定，主要是轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子及與細胞壁修飾相關(guān)基因。如有機酸轉(zhuǎn)運蛋白—Al激活蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白（Aluminum-activated malate transporter，）基因[17]、轉(zhuǎn)運檸檬酸的多藥和有毒化合物排出家族蛋白（Multidrug and toxinextrusion protein，）基因[18]、耐Al轉(zhuǎn)錄因子（Resistance transcription factor1，）[19]、調(diào)控Al脅迫基因表達的對低pH敏感轉(zhuǎn)錄因子（Sensitive to proton rhizotoxicity 1，）[20-21]，與細胞壁修飾相關(guān)的對Al根際毒害敏感基因（Sensitive to Al rhizotoxicity 1）和[22]，以及促進果膠分子的去酯化的果膠酯酶基因等。

高通量測序技術(shù)的發(fā)展，為從轉(zhuǎn)錄組水平闡明高等植物響應(yīng)Al的基因表達網(wǎng)絡(luò)，挖掘耐Al候選基因提供了全面、高效的手段。通過轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組等技術(shù)手段揭示茶樹耐Al的分子機理已有相關(guān)報道，部分候選基因和相關(guān)蛋白被相繼鑒定出來。Xu等[23]采用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)對茶樹受Al3+脅迫下的葉片和根系的蛋白差異表達進行了研究，最終從根系和葉片中分別鑒定到755個和1?059個差異蛋白，根系中富集的上調(diào)表達蛋白多數(shù)參與糖酵解代謝而葉片中富集的上調(diào)表達蛋白多涉及光合作用；此外，抗氧化酶和檸檬酸鹽合成相關(guān)蛋白也在根系中積累來響應(yīng)Al3+脅迫。Li等[24]利用RNA-Seq技術(shù)分析了0、0.2、1?mmol·L-1Al3+濃度處理3?h后根系轉(zhuǎn)錄組變化，鑒定到一批涉及轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、氧化應(yīng)激通路蛋白，以及多糖和細胞壁代謝、能量和次級代謝、有機酸陰離子和酶分泌等差異表達基因，包括等。Zhao等[25]進一步分析了50個茶樹品種基因序列，發(fā)現(xiàn)5個阿薩姆茶樹品種中出現(xiàn)了9?bp堿基序列的缺失，推測基因中這9?bp堿基序列的變異可能與茶樹Al富集相關(guān)。Fan等[26]探索了Al3+促進茶根系生長與養(yǎng)分吸收的機理，利用RNA-seq對0、0.4、4?mmol·L-1Al3+處理下的根系進行差異基因挖掘，聚類分析顯示，一些參與細胞生長與分裂相關(guān)途徑基因可能參與了不同Al供應(yīng)下對根系生長的調(diào)控，參與K吸收的的表達與側(cè)根中K含量呈正相關(guān)，預(yù)示著Al可能通過上調(diào)相關(guān)基因表達進而促進K離子的吸收和細胞的生長與分裂來促進茶樹根系生長。寧秋燕[27]對Al3+處理下根尖細胞壁膨大與重組過程中的關(guān)鍵蛋白木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶（）和伸展蛋白（）進行了表達分析，結(jié)果表明Al3+短期處理中和基因在根尖迅速上調(diào)表達，這可能對于Al3+促進茶樹后期根系的顯著性伸長、分生生長具有關(guān)鍵性作用。

茶樹基因組的發(fā)表為進一步闡明茶樹重要生命活動規(guī)律提供了堅實的基礎(chǔ)。基于RNA-Seq鑒定不同Al3+水平調(diào)控的關(guān)鍵基因，是解析茶樹Al耐受分子機理的重要手段。本研究利用RNA-seq技術(shù)構(gòu)建了茶樹無Al3+、適宜Al3+和高Al3+濃度處理下的根系轉(zhuǎn)錄組文庫，鑒定茶樹根系響應(yīng)Al3+脅迫的應(yīng)答基因，增加對茶樹耐Al機制的認(rèn)識，為進一步篩選茶樹耐Al相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

供試材料為福鼎大白茶生長良好、大小一致的一年生扦插苗，茶苗由湖北大悟縣半兵衛(wèi)茶業(yè)有限公司提供。2018年3—8月，試驗培養(yǎng)箱采用40.0?cm×30.0?cm×15.0?cm的藍色不透明塑料箱，箱蓋帶有20個獨立開孔，每孔放入1株茶苗，用海綿固定，培養(yǎng)室光照強度＞450?μmol·m-2；溫度(22~25)℃，16?h光照/8?h黑暗，空氣濕度65%~85%。先用純蒸餾水預(yù)培養(yǎng)3?d。隨后移至營養(yǎng)液中。營養(yǎng)液參照文獻[3]的配方，用0.1?mol·L-1H2SO4或NaOH調(diào)pH至5.0，每隔7?d更換1次營養(yǎng)液并持續(xù)通氣。待茶苗長出大量白色吸收根后用于后續(xù)Al處理。Al處理采用A12(SO4)3·18H2O，設(shè)置0、0.2、1、2、4?mmol·L-15個Al3+濃度，各組重復(fù)3次。處理7?d后，取每盆5株茶樹幼根于液氮速凍，作為1個重復(fù)樣，然后置于–80℃冰箱保存，備用。

1.2 抗氧化酶活性測定

采用南京建成生物工程研究所的總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒（羥胺法）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（可見光法）、過氧化物酶（POD）測定試劑盒（比色法）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）測試盒（紫外比色法），根據(jù)試劑盒提供的說明測定茶樹根系總SOD、CAT、POD、APX 4種抗氧化酶活性，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 Al含量測定

Al含量測定參考王敏等[3]方法。取液氮磨碎的鮮樣0.4?g至玻璃消化管，依次加入5?mL HNO3與2?mL HClO4，蓋上蓋子，60℃預(yù)消煮2?h后，120℃消煮至消煮液無色澄清透明，冷卻后，用雙蒸水稀釋至50?mL。取10?mL使用ICP-OES（電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法）測定Al元素的含量，每個處理3次生物學(xué)重復(fù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：用1%稀硝酸將Al標(biāo)準(zhǔn)儲備液（國家有色金屬及電子材料分析測試中心）逐級稀釋為0、5、10、30、40、50?μg·mL-1，儀器自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 總RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序

每個處理3次生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)由5株茶樹根系混合而成。采用改良的CTAB法[28]提取茶樹根系總RNA，Nanodrop檢測RNA濃度，1%的瓊脂糖電泳檢測RNA完整性，Labchip對RNA精確質(zhì)檢。質(zhì)檢合格后送武漢博越致和生物科技有限公司構(gòu)建RNA-Seq文庫，并在Illumina Hiseq Xten平臺上進行測序。

1.5 數(shù)據(jù)質(zhì)控及過濾

測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別（Base calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列（Raw reads），結(jié)果以FASTQ文件格式存儲，其中包含測序序列（Reads）的序列信息及其對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。Raw reads經(jīng)過濾去除接頭序列和低質(zhì)量序列得到獲得純凈reads（Clean reads）。

1.6 參考序列比對分析

采用Hisat2軟件，以茶樹基因組[29]作為參考基因組，將clean reads比對到參考基因組序列，使用Hisat2軟件，參考基因組選“C.sinensis.genome.fa”文件，注釋文件選擇“C.sinensis.gene.gtf”文件，對測序得到的reads比對情況做出評價。本研究所有基因注釋ID都以茶樹基因組基因ID表示。

1.7 差異表達基因的篩選和功能注釋

采用FPKM值（Fragments per kilo bases per million mapped reads，代表每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù)）來反映基因的表達量[30]。采用DESeq2表現(xiàn)基因的讀段數(shù)在不同生物學(xué)個體之間的差異。在DESeq2的統(tǒng)計結(jié)果中，通過差異倍數(shù)[|log2(Fold change)|>1]和FDR（False discover rate）≤0.05為篩選條件，在3個轉(zhuǎn)錄組比較組合中（R1 VS R0，R4 VS R0，R4 VS R1）篩選差異表達基因。對找到的差異表達基因利用EggNOG數(shù)據(jù)庫（http://eggnogdb.embl.de）和emapper工具進行GO注釋，獲得基因的Orthologous groups，然后用R語言的phyper函數(shù)進行超幾何分布檢驗。以Q-value≤0.05為閾值定義差異表達基因中顯著富集的GO terms。采用R語言的clusterProfiler包進行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析，確定差異表達基因參與的代謝途徑。

1.8 差異表達基因熒光定量PCR驗證

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化酶活性及Al含量變化

植物遭受逆境脅迫時體內(nèi)產(chǎn)生活性氧，引起膜脂過氧化和膜系統(tǒng)損傷，而抗氧化酶可清除植物體內(nèi)的活性氧，且不同酶對逆境有不同的響應(yīng)。由圖1可知，無Al3+時根系POD活性顯著高于其他Al3+濃度下POD活性，且隨著Al濃度的升高，根系POD活性逐漸下降。SOD活性在Al3+濃度為1?mmol·L-1時最高，其他處理無顯著差異。APX活性隨著Al3+濃度的增加逐漸升高。不同Al3+濃度處理下茶樹根系CAT活性無顯著差異。

由圖2可知，在0~1?mmol·L-1Al3+濃度范圍內(nèi)，根系中Al含量隨著Al3+濃度的升高呈上升趨勢，在Al3+濃度為1?mmol·L-1時達到最高。當(dāng)Al3+濃度為2?mmol·L-1和4?mmol·L-1時，Al含量均下降，但根系中Al含量仍高于0~0.2?mmol·L-1Al3+處理，表明高Al3+濃度對茶樹根系造成了一定損傷，抑制了根系對Al3+的吸收。

表1 用于qRT-PCR表達驗證的8個基因及其引物

注：FW表示鮮重，mgprot為毫克蛋白數(shù)；數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）。柱形圖上不同字母表示P<0.05，相同字母間無顯著差異

注：數(shù)據(jù)為3 次重復(fù)的平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（ n=3 ）。折線圖上不同字母表示P<0.05，相同字母間無顯著差異

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析及差異基因篩選結(jié)果

測序原始數(shù)據(jù)堿基組成基本平衡，并且堿基百分比（Q30）大于92%。充分說明測序得到的數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，可滿足后續(xù)分析。9個樣品共得到3?137.9萬~4?292.6萬對100?bp的reads，將包含測序接頭和低質(zhì)量reads去除后，得到1?984.2萬~4?154.3萬對clean reads，占原始序列的93.5%~98.0%。與茶樹基因組進行基因序列比對，從比對結(jié)果來看（表2），R0、R1、R4平均分別有67%、69%和67%的reads能有效地比對到參考序列上，成功注釋到參考基因的unique reads占總reads的比例依次為50.1%、47.0%和46.4%。

從基因表達水平分布圖可以看出（圖3-A），3個樣品的表達水平相似，log10(FPKM+1)值主要集中在1左右。經(jīng)篩選得到不同比較間（R1 VS R0，R4 VS R0，R4 VS R1）的DEGs（圖3-B）。R1與R0的DEGs為1?894個，上、下調(diào)基因分別為733個和1?161個；R4與R0的DEGs為2?439個，上、下調(diào)基因分別為846個和1?593個；R4與R1的DEGs為1?384個，上、下調(diào)基因分別為628個和756個（圖3-C）。R1 VS R0，R4 VS R0，R4 VS R1共有的差異表達基因為120個。

表2 不同Al濃度處理茶樹根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.3 差異表達基因的Gene Ontology富集分析

GO（Gene ontology）數(shù)據(jù)庫可用于描述基因產(chǎn)物的功能。通過GO富集分析可以尋找與差異表達基因相關(guān)的主要特征功能分類。利用emapper工具對所有基因進行GO注釋。結(jié)果表明，共有7?366條基因注釋到其參與的生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）及細胞組分（Cellular Component，CC）三大功能分支條目上，揭示茶樹響應(yīng)不同濃度Al3+相關(guān)基因的多樣性。GO富集分析結(jié)果表明（圖4），在生物學(xué)途徑中，R1 VS R0有606個DEGs（占總DEGs的32.0%）被注釋，涉及基因數(shù)目較多的條目依次是刺激響應(yīng)（358個，占59.1%）、脅迫響應(yīng)（229個，占37.8%）、化學(xué)響應(yīng)（209個，占34.5%）、非生物脅迫響應(yīng)等3個生物學(xué)過程；R4 VS R0中有1?168個DEGs（占總DEGs的47.9%）被注釋，其中富集最多的類別與R1 VS R0相同；R4 VS R1中有408個DEGs（占總DEGs的47.5%）被注釋，富集最多的類別同樣是刺激響應(yīng)（225個，占比55.1%）。

在分子功能方面，R1 VS R0有429個基因（占總差異基因的42.5%）被注釋，主要富集在核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（109個，占比25.4%）中；R4 VS R0共有551個DEGs（占總DEGs的22.6%）被注釋，其中富集最多的也是核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（127個，占23.0%）。R4 VS R1共有301個DEGs（占總DEGs的21.7%）被注釋，富集最多的類別是氧化還原酶活性相關(guān)基因（45個，占比15.0%）。

在細胞組件方面，R1 VS R0有804個DEGs（占總DEGs的22.7%）被注釋，涉及到細胞壁、液泡、細胞膜、細胞質(zhì)等幾乎所有細胞組分。其中，富集差異基因數(shù)目較多的分別是細胞外圍（310個，占比38.6%）、細胞外區(qū)域（124個，占比15.2%）、細胞壁（122個，占比15.2%）、外部封裝結(jié)構(gòu)（122個，占比15.2%）、質(zhì)外體（74個，占比9.2%）等細胞組件。R4 VS R0共有1?025個DEGs（占總DEGs的42.0%）被注釋，其中富集最多的前6個基因類別有5個與R1 VS R0相同，此外還包括細胞質(zhì)膜（272個，占比26.5%）。R4 VS R1有579個DEGs（占總DEGs的41.8%）被注釋，其中富集最多的基因類別是膜（290個，占比50.1%），其次為細胞外區(qū)域、細胞壁、外部封裝結(jié)構(gòu)、質(zhì)外體等。

圖3 R0、R1、R4 3個樣本基因表達水平分布圖（A）、差異表達基因的交集分析（B）和上、下調(diào)差異表達基因個數(shù)（C）

注：1：刺激響應(yīng)；2：脅迫響應(yīng)；3：化學(xué)響應(yīng)；4：非生物脅迫響應(yīng)；5：有機物響應(yīng)；6：激素響應(yīng)；7：氧化還原過程；8：脫水響應(yīng)；9：對水分的響應(yīng)；10：次級代謝過程；11：細胞外圍；12：細胞外區(qū)域；13：細胞壁；14：外部封裝結(jié)構(gòu)；15：質(zhì)外體；16：植物型細胞壁；17：膜；18：細胞質(zhì)膜；19：類囊體；20：轉(zhuǎn)錄因子活性，序列特異性DNA結(jié)合；21：核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；22：羧酸酯水解酶活性；23：果膠酯酶活性；24：木葡聚糖:低聚木糖葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性；25：氧化磷酸化解耦活性；26：轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移己糖基；27：水解酶活性，水解O-糖基化合物；28：水解酶活性，作用于糖基鍵；29：轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移烷基或芳基（甲基除外）基團；30：氧化還原酶活性；31：氧化還原酶活性，作用于CH-OH供體；32：氧化還原酶活性，作用于以NAD或NADP為受體的CH-OH供體組；33：酒精脫氫酶（NADP+）活性；34：醛酮還原酶（NADP）活性；35：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性

2.4 差異表達基因的KEGG富集分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對篩選出的DEGs進行了功能分類和Pathway注釋。結(jié)果表明，R1 VS R0有634個DEGs（占總DEGs的33.5%）可以詳細注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中337條代謝通路中，R4 VS R0有810個DEGs（占總DEGs的33.3%）注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中344條代謝通路中，R4 VS R1有505個DEGs（占總DEGs的36.5%）注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中316條代謝通路中。R1 VS R0、R4 VS R0、R4 VS R1分別顯著富集了29、41、19條Pathway。由表3可知，R1 VS R0顯著富集的Pathway中注釋到轉(zhuǎn)錄因子中的基因最多（53個，占8.4%），其次是植物-病原菌互作途徑（48個，占7.6%）、苯丙烷生物合成途徑（39個，占6.2%）、細胞色素P450途徑（35個，占5.5%）、戊糖和葡萄糖酸鹽相互轉(zhuǎn)化途徑（25個，占3.9%）等。R4 VS R0和R4 VS R1富集最多的Pathway均為轉(zhuǎn)運蛋白（109個和60個，占比13.5%和11.9%），此外，R4 VS R0顯著富集到了轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因，R4 VS R1則富集到了與苯丙烷生物合成途徑和參與光合作用的蛋白等相關(guān)基因。

2.5 抗氧化酶相關(guān)基因

以無Al3+處理（R0）為對照，本研究在R1中分離到了8個上調(diào)表達的抗氧化酶基因（7個和1個）和15個下調(diào)表達的抗氧化酶基因（9個和6個）；在R4中分離到了31個抗氧化酶基因，其中5個上調(diào)表達（4個和1個），26個下調(diào)表達（13個、12個和1個）。表明隨著Al3+濃度的提高，抗氧化酶基因多呈下調(diào)表達趨勢，特別是，這與本研究測定的POD活性變化相一致。

表3 KEGG顯著富集的前5條代謝通路

2.6 轉(zhuǎn)運蛋白與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因

植物對Al3+的吸收和解毒是一個復(fù)雜精密的過程，其中，轉(zhuǎn)運蛋白參與了吸收轉(zhuǎn)運、螯合、區(qū)隔化和代謝利用等調(diào)控過程，發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從茶樹根系中鑒定出了許多與細胞轉(zhuǎn)運有關(guān)的差異表達基因，包括編碼蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因，檸檬酸轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因，ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporters），金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白（如鎂轉(zhuǎn)運蛋白、鋅轉(zhuǎn)運蛋白、銅轉(zhuǎn)運蛋白），硝酸、磷酸和硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，銨轉(zhuǎn)運蛋白，氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白，水通道蛋白等相關(guān)基因。以無Al3+處理（R0）為對照，在R1和R4處理組中分別鑒定到6個（4個上調(diào)，2個下調(diào)）和9個（6個上調(diào)，3個下調(diào)）ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因，表明ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因在茶樹根中的表達隨著Al3+濃度的提高而上調(diào)。在R1和R4中分別鑒定到1個MATE家族蛋白基因，均為下調(diào)表達。此外，在R1中鑒定到1個下調(diào)表達的硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因，在R4樣本中鑒定出2個上調(diào)表達和1個下調(diào)表達的硫酸鹽轉(zhuǎn)運基因、1個下調(diào)表達的亞硫酸鹽外排基因TauE/SafE。R4處理組中還發(fā)現(xiàn)4個水通道蛋白基因（1個上調(diào)，3個下調(diào)），以及4個硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因、3個氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因、1個磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因、1個鎂轉(zhuǎn)運蛋白基因、1個鋅轉(zhuǎn)運蛋白基因、1個鉀轉(zhuǎn)運蛋白基因，均為下調(diào)表達。高Al3+濃度（R4）與適宜Al3+濃度（R1）處理組間相比，鑒定得到與蘋果酸分泌有關(guān)的1個在R4處理的茶樹根系中顯著上調(diào)表達，而R1處理時的表達量比無鋁處理時有所下降，表明可能參與Al3+誘導(dǎo)的茶樹根蘋果酸分泌；還鑒定到了7個ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因（2個上調(diào)，5個下調(diào)），2個硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因（1個上調(diào)，1個下調(diào)），2個下調(diào)的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因和2個下調(diào)的銨轉(zhuǎn)運蛋白基因，1個上調(diào)的銅轉(zhuǎn)運蛋白基因和1個下調(diào)的鎂轉(zhuǎn)運蛋白基因，1個上調(diào)表達的水通道蛋白基因等。

植物在響應(yīng)生物和非生物脅迫時，大量轉(zhuǎn)錄因子被誘導(dǎo)表達，以應(yīng)對環(huán)境刺激。本研究在茶樹根中鑒定了多種類型的轉(zhuǎn)錄因子，包括WRKY、MYB、BZip、熱休克因子、乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子等。以無Al3+處理（R0）為對照，在R1和R4處理中分別鑒定到9個和12個WRKY轉(zhuǎn)錄因子、1個乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子、2個gata轉(zhuǎn)錄因子、1個BZip轉(zhuǎn)錄因子，均下調(diào)表達；鑒定得到1個熱休克因子在R1中下調(diào)表達，在R4中則上調(diào)表達；此外，在R1中鑒定到1個上調(diào)表達的STOP1轉(zhuǎn)錄因子；在R4中鑒定到2個MYB轉(zhuǎn)錄因子，1個下調(diào)表達，1個上調(diào)表達。高Al3+濃度（R4）與適宜Al3+濃度（R1）處理組間相比，在茶樹根中鑒定到2個下調(diào)表達的，表明茶樹中的不受高Al3+濃度誘導(dǎo)；4個WRKY轉(zhuǎn)錄因子，其中3個上調(diào)表達，1個下調(diào)表達，還檢測到1個下調(diào)表達的MYB轉(zhuǎn)錄因子。

2.7 細胞壁形成與修飾相關(guān)基因

Al3+脅迫下，植物細胞壁的屬性、組分及與細胞壁相關(guān)聯(lián)的酶和基因都會受到影響。以無Al3+處理（R0）為對照，本研究在R1和R4樣本中分別鑒定到1個上調(diào)表達的胼胝質(zhì)合成酶（Callose synthase）基因，6個（2個上調(diào)表達，4個下調(diào)表達）和10個（3個上調(diào)表達，7個下調(diào)表達）纖維素合酶及其類似蛋白（Cellulose synthase/-like protein）基因，17個（14個上調(diào)，3個下調(diào)）和12個（9個上調(diào)，3個下調(diào)）果膠酯酶（Pectinesterase，PEs）基因，以及8個木葡聚糖內(nèi)切水解酶（Xyloglucan endo-hydrolase，XEH）基因和3個木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖基酶（Xyloglucan endo-transglycosylase，XET）基因，在R1和R4樣本中均下調(diào)表達。高Al3+濃度（R4）與適宜Al3+濃度（R1）處理組間相比，鑒定到2個上調(diào)表達的胼胝質(zhì)合成酶基因，2個上調(diào)表達的果膠裂解酶基因，1個上調(diào)表達的木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖基酶基因，8個果膠酯酶基因（2個上調(diào)，6個下調(diào)）和2個纖維素合酶（1個上調(diào)，1個下調(diào)）基因。

2.8 差異表達基因的 qRT-PCR 熒光定量分析

為了驗證RNA-Seq結(jié)果的可靠性，隨機挑選了8個基因進行qRT-PCR表達分析。結(jié)果表明，8個基因的表達變化趨勢與RNA-Seq結(jié)果（圖5）較為一致，證明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)具有較高的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

3 討論

本研究應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)對茶樹無Al3+（0?mmol·L-1，R0）、適宜Al3+（1?mmol·L-1，R1）和高Al3+（4?mmol·L-1，R4）濃度處理下的根系轉(zhuǎn)錄組進行了比較分析，獲得了大量差異表達基因。GO功能富集分析顯示這些差異表達基因所參與的生物學(xué)過程主要包括刺激和脅迫響應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等過程。差異表達基因的分子功能主要包括核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、果膠酯酶、氧化還原以及物質(zhì)轉(zhuǎn)運等功能。差異表達基因的Pathway顯著性富集分析進一步表明差異基因廣泛涉及轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運蛋白、植物-病原菌互作、苯丙烷生物合成等生物學(xué)路徑。

在茶樹中，Mukhopadyay等[32]研究表明，在0~0.4?mmol·L-1Al3+范圍內(nèi)，隨Al3+濃度的升高，茶樹品種T-78根系SOD、POD、CAT、APX活性均顯著提高；當(dāng)Al3+濃度超過脅迫點4?mmol·L-1時，這些酶活性迅速降低。本研究中，根系SOD和APX表現(xiàn)出相似的趨勢，這與Li等[33]研究結(jié)果一致；但POD活性隨著Al3+濃度的升高逐漸下降，CAT活性則無顯著差異，這可能與不同品種的耐Al性的遺傳差異性有關(guān)。Al3+還能誘發(fā)多個抗氧化酶基因的表達來降低ROS的產(chǎn)生，促使植物從ROS誘導(dǎo)的損傷中恢復(fù)[34-35]。例如，過表達谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因和POD基因，增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對Al3+脅迫的耐受性[36]。本研究中，在茶樹中檢測到的抗氧化酶基因主要是和，在不同的Al3+濃度下，兩基因的表達量存在顯著差異，這與李勇[37]的研究結(jié)果相似，表明這兩種抗氧化酶基因在茶樹耐鋁中發(fā)揮重要作用。

注：A：谷氨酰胺合成酶；B：黃烷酮3-羥化酶；C：生長素響應(yīng)蛋白；D：果膠酶；E：植物果膠甲酯酶抑制；F：植物果膠甲酯酶抑制家族蛋白DC；G：水通道蛋白；H：谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶

本試驗篩選出的轉(zhuǎn)運蛋白和轉(zhuǎn)錄因子種類，與Al3+處理的大豆[38]和柑橘[39]根中的研究結(jié)果相似，表明這些基因?qū)τ阡X的解毒機制可能具有類似的作用機理，茶樹可能具有與這些物種相似的一些耐Al機制。植物ABC轉(zhuǎn)運蛋白能與外源有毒物質(zhì)相結(jié)合，將其從細胞質(zhì)基質(zhì)中轉(zhuǎn)運進液泡，以達到解毒的作用，減少對植物細胞的損害[40]。例如，水稻Al轉(zhuǎn)運蛋白可將質(zhì)外體中的Al清除，并在ABC-轉(zhuǎn)運蛋白的協(xié)同作用下將Al區(qū)隔化到液泡中，從而達到解Al毒的目的[41]。本研究篩選到多個ABC轉(zhuǎn)運蛋白受不同Al3+濃度誘導(dǎo)上調(diào)表達，Li等[24]對Al3+處理后嘉茗1號實生幼苗根尖轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果獲得最多的轉(zhuǎn)運蛋白也為ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族基因，說明這些基因可能參與茶樹體內(nèi)Al的區(qū)隔化。有研究表明，硫（Sulphur，S）可緩解小麥[42]、大麥[43]和柑橘[44]中的Al毒害。高Al3+濃度下，茶樹根系硫酸鹽轉(zhuǎn)運基因上調(diào)表達，亞硫酸鹽外排基因TauE/SafE則下調(diào)表達，表明Al3+脅迫下根可能通過增加S的吸收，減少S的輸出，從而提高細胞S水平，緩解Al3+毒害，這些S轉(zhuǎn)運有關(guān)的基因可能在茶樹耐Al性中起作用。此外，還有金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白（如鎂轉(zhuǎn)運蛋白、鋅轉(zhuǎn)運蛋白、銅轉(zhuǎn)運蛋白）、硝酸和磷酸轉(zhuǎn)運蛋白、銨轉(zhuǎn)運蛋白、氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白等基因，也在茶樹根系中發(fā)現(xiàn)其表達量存在顯著差異，這些基因可能通過影響相應(yīng)的金屬離子、氨基酸和滲透物質(zhì)等的轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)和維持細胞穩(wěn)態(tài)。水通道蛋白（Aquaporin）可運輸如NH3、尿素等小分子基團。Negishi等[45]在鋁富集植物繡球花中鑒定到了2個分別位于液泡膜和細胞質(zhì)膜上的水通道蛋白基因，它們具有轉(zhuǎn)運Al3+功能。Li等[24]在高鋁/適宜鋁處理組中篩選到3個水通道蛋白，其中2個下調(diào)表達，1個上調(diào)表達。本研究在R4與R1的處理組中篩選到1個下調(diào)表達的水通道蛋白，推測其在茶樹中也具有跨膜轉(zhuǎn)運鋁的作用，從而影響茶樹對鋁的富集作用。

本試驗篩選出的部分轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)控模式和功能已在模式作物擬南芥和水稻中有了深入分析。例如，編碼1個C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控質(zhì)子和Al脅迫/耐性基因的表達[18,20]。本研究鑒定到的在R1 VS R0處理組間上調(diào)表達，而在R4 VS R1處理組則出現(xiàn)下調(diào)表達，表明茶樹中的不受高Al3+濃度誘導(dǎo)。已有的研究表明，可能只是調(diào)控下游耐Al基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，再由這些轉(zhuǎn)錄因子來誘導(dǎo)下游基因的表達，兩者協(xié)同作用共同調(diào)控耐Al基因的表達，因而，在轉(zhuǎn)錄水平不受Al3+誘導(dǎo)[46]。植物中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子在各種非生物脅迫中發(fā)揮重要作用，包括Al3+脅迫[47]。擬南芥中也鑒定到多個WRKY轉(zhuǎn)錄因子受Al3+誘導(dǎo)表達上調(diào)或下調(diào)[48-49]。Ding等[50]研究表明在擬南芥中被Al3+抑制，并負調(diào)節(jié)的表達。本研究在不同Al3+濃度處理下鑒定到的WRKY轉(zhuǎn)錄因子均下調(diào)表達，表明Al3+處理抑制了茶樹根系中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達。

植物抵御不良環(huán)境脅迫時，胼胝質(zhì)在細胞壁與細胞膜之間沉積，可維持或保護細胞壁和質(zhì)膜的正常功能。Al3+誘導(dǎo)的根胼胝質(zhì)合成是耐Al性評價的重要指標(biāo)[51]。不同Al3+處理濃度下，胼胝質(zhì)合成酶（Callose synthase）基因均上調(diào)表達，表明Al3+促進了茶樹根系胼胝質(zhì)合成。此外，鑒定到纖維素合酶及其類似蛋白以下調(diào)表達居多。Al3+誘導(dǎo)的纖維素合酶的下調(diào)也與茶樹根胼胝質(zhì)合成酶上調(diào)表達結(jié)果相呼應(yīng)，因為Al3+誘導(dǎo)的纖維素合成抑制有利于胼胝質(zhì)的合成[52]。果膠是植物細胞壁的重要組成成分，Al3+可與細胞壁果膠相互作用，導(dǎo)致細胞壁硬化，使根細胞伸長受到抑制[53]。果膠酯酶催化果膠的去酯化和脫乙?；?，促使細胞壁松弛，從而補償Al引起的細胞壁硬化。與R0相比，R1和R4中果膠酯酶基因多上調(diào)表達，這些基因的表達上調(diào)可能有助于提高其耐Al性，緩解高濃度Al引起的根伸長抑制。木葡聚糖是雙子葉植物初生細胞壁最豐富的半纖維素多糖，木葡聚糖內(nèi)源轉(zhuǎn)糖基酶/水解酶（Xyloglucan endo-transglucosylase/hydrolase， XTH）通過催化木葡聚糖的內(nèi)轉(zhuǎn)糖基化，或通過催化木葡聚糖的水解，從而促進細胞壁松弛[54-55]。本研究從茶樹根中鑒定到8個和3個，在R1和R4處理中均下調(diào)表達。寧秋燕[27]分析了和在不同Al3+濃度處理下龍井43和白葉1號兩個茶樹品種中的表達差異，結(jié)果表明，Al3+處理7?d后，龍井43根系表達量在0.4、1?mmol·L-1和4?mmol·L-1均下調(diào)表達，則在1?mmol·L-1時表達下調(diào)，本研究與其結(jié)果類似。Yang等[56]研究表明Al3+處理后擬南芥根XET活性的明顯降低可能是導(dǎo)致Al3+脅迫下擬南芥根伸長受抑制的原因，同時Al3+誘導(dǎo)的XET活性受抑制和肼胝質(zhì)在擬南芥根中的累積是同步的。本研究中茶樹根系下調(diào)表達與胼胝質(zhì)合酶的上調(diào)表達也是同步的，與其結(jié)果類似。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析，獲得了茶樹根在無Al3+（0?mmol·L-1，R0）、適宜Al3+（1?mmol·L-1，R1）和高Al3+（4?mmol·L-1，R4）3個Al3+濃度處理下的基因表達譜數(shù)據(jù)，鑒定到參與Al3+誘導(dǎo)茶樹生理調(diào)控的活性氧代謝、轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和細胞壁組分與修飾等多個相關(guān)基因，為解析茶樹Al耐受分子機理研究提供了重要基因信息。

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Transcriptome Analysis of Root Induced by Aluminum in Tea Plants ()

HUANG Danjuan1, TAN Rongrong1, CHEN Xun1, WANG Hongjuan1, GONG Ziming1, WANG Youping2, MAO Yingxin1*

1. Institute of Fruit and Tea, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China;2. Institute of Plant Protection, Soil and Fertilizers, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China

The aim of this study was to investigate the gene regulation network and expression pattern of the response to aluminum (Al) in tea plants, and to identify the key candidate genes for understanding molecular mechanism of Al tolerance in tea plants. The roots’ antioxidant enzyme activities and Al content of Fuding Dabaicha cultivar were detected under 0?mmol·L-1, 0.2?mmol·L-1, 1?mmol·L-1, 2?mmol·L-1and 4?mmol·L-1Al3+concentrations for 7?d. The total RNA of roots under 0?mmol·L-1(R0), 1?mmol·L-1(R1) and 4?mmol·L-1(R4) Al3+concentrations were extracted for high-through transcriptome sequencing by Illumina Hiseq Xten platform. The results showed that with the increase of Al concentration, POD activity decreased while APX activity increased gradually. SOD activity reached the highest peak at the Al concentration of 1?mmol·L-1. However, CAT activity showed no significant difference among five treatments. The Al content first increased and then decreased with the increase of Al3+concentration, and reached the highest peak at the Al3+concentration of 1?mmol·L-1.The DEGs of R1 VS R0, R4 VS R0, R4 VS R1 were 1?894, 2?439 and 1?384 respectively with 733 (1?161), 846 (1?593) and 628 (756) DEGs significantly up-regulated (down-regulated). GO enrichment analysis shows that the most enrichment biological pathway of three samples were all stimulus responses. In terms of molecular function and cell components, R1 VS R0 and R4 VS R0 were mostly enriched in nucleic acid binding transcription factor activity and cell periphery, while R4 vs R1 were mostly enriched in redox enzyme activity and membrane. KEGG enrichment analysis illustrates that they were significantly enriched in 29, 41, and 19 pathways, respectively, including transcription factors, transporters, plant-pathogen interactions, and phenylpropanoid biosynthesis pathways. It was found that genes involved in physiological processes such as reactive oxygen metabolism, organic acids or metal transporters, transcription factors and cell wall structure modification were up-regulated or inhibited after Al induction, suggesting that these genes were closely related to the molecular mechanism of Al tolerance in tea plants.

, aluminum, root, differential expressed genes, RNA sequencing

S571.1；Q52

A

1000-369X(2019)05-506-15

2019-05-21

2019-06-28

國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0200900）、中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項（2018ZYYD009）、湖北省農(nóng)科院青年科學(xué)基金（2018NKYJJ15）、國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）、湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心團隊（2016-620-000-001-032）

黃丹娟，女，助理研究員，主要從事茶樹栽培生理研究，E-mail: huangdjtea@163.com。*通信作者：maoyingxin@126.com