劉艷麗，馬林龍，曹丹，金孝芳，馮琳，龔自明

茶樹果膠乙酰酯酶家族成員的鑒定和生物信息學(xué)分析

劉艷麗，馬林龍，曹丹，金孝芳*，馮琳，龔自明

湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所，湖北 武漢 430209

茶樹是氟的超富集植物，葉片高氟含量與人體健康密切相關(guān)。果膠乙酰酯酶（PAE）可能通過調(diào)控果膠的去乙?；饔脜⑴c茶樹葉片對氟的富集和解毒，然而目前并無茶樹PAEs的相關(guān)報(bào)道。本研究以茶樹舒茶早基因組和三代測序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)的方法開展了PAEs的鑒定及其特性、進(jìn)化和定位分析。結(jié)果表明，在茶樹中，PAE家族有12個蛋白，屬于PAE5、PAE8、PAE9、PAE10、PAE12等5個成員，具有CLDG、PxYH、GGGWC、GS、NWN、rYCDG、GCSAG、NaAYDSWQ、HCQ等9個保守基序；在進(jìn)化關(guān)系上，茶樹PAEs與葡萄、可可親緣關(guān)系較近；12個CsPAEs氨基酸大小為326~515，分子量為36.7~56.9?kDa，等電點(diǎn)為5.1~8.9；除CsPAE5、CsPAE5-1定位線粒體，CsPAE10-1可能定位胞質(zhì)外，其他9個CsPAEs定位細(xì)胞壁；CsPAE5、CsPAE5-1、CsPAE12和CsPAE12-1為跨膜蛋白。此研究結(jié)果將為解析PAE在茶樹葉片氟富集和解毒過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

茶樹；果膠乙酰酯酶；鑒定；生物信息學(xué)分析

植物細(xì)胞壁通常由多糖（纖維素、半纖維素和果膠）和結(jié)構(gòu)蛋白組成，其中果膠是主要組分[1]。果膠是一類富半乳糖醛酸（GalA，通過-1,4糖苷鍵連接）的多糖，主要由同聚半乳糖醛酸（HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖I（RG-I）、鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ（RG-Ⅱ）和木糖半乳糖醛酸聚糖（XGA）4個結(jié)構(gòu)域組成[2-4]。據(jù)報(bào)道，HG和RG-I骨架上半乳糖醛酸C2或C3羥基常發(fā)生乙?；揎梉5]。此外，也有報(bào)道RG-I中的鼠李糖及RG-Ⅱ側(cè)鏈上的巖藻糖和槭汁酸C3位發(fā)生乙酰化修飾[6-7]。果膠乙?；l(fā)生在果膠從高爾基體向細(xì)胞壁分泌的過程中，然后乙?；墓z結(jié)合進(jìn)細(xì)胞壁[8-9]。果膠乙?；淖兞斯z組分的理化性質(zhì)，影響了細(xì)胞的粘連進(jìn)而影響了細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)[10]。果膠乙?；某潭仁芄z乙酰酯酶（Pectin acetylesterase，PAE）的調(diào)控，PAE具有切割乙酰酯鍵對果膠進(jìn)行去乙酰化的作用[9,11]。

研究表明，果膠甲基酯酶（Pectin methylesterase，PME）調(diào)控果膠去甲基化，使果膠中自由基團(tuán)增多，進(jìn)而使細(xì)胞壁具有吸附結(jié)合更多重金屬離子的能力。PAE可能同PME一樣，通過調(diào)控果膠乙?；辜?xì)胞壁具吸附結(jié)合更多重金屬離子的能力[4]，從而參與植物細(xì)胞壁對重金屬的富集和解毒。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道PAE參與植物生長發(fā)育繁殖過程[9,11]、果實(shí)硬度變化[12]及植物防御生物和非生物脅迫[13-16]。Pogorelko等[14]研究發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)構(gòu)巢霉菌的轉(zhuǎn)基因擬南芥和二穗短柄草對病原菌具有更高的抗性；楊志遠(yuǎn)等[15]發(fā)現(xiàn)擬南芥T-DNA插入突變體對大豆疫霉菌更為敏感。然而，PAE參與植物重金屬富集和解毒的報(bào)道一直缺乏。最近，我們利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)策略探討茶樹葉片對氟脅迫的響應(yīng)時發(fā)現(xiàn)PAE顯著上調(diào)表達(dá)，表明其參與葉片氟富集和解毒過程[16]。

茶樹[(L.) O. Kuntze]是氟的超富集植物，其葉片高氟含量與人體健康密切相關(guān)。鑒于PAE參與茶樹葉片氟富集和解毒過程，解析茶樹PAE將有助于對葉片氟富集和解毒機(jī)制的了解。在高等植物中，PAE屬于CE13超家族成員，有10個左右PAE成員，具有保守的PAE結(jié)構(gòu)域[5,17]。然而，截止目前尚無茶樹PAE家族成員的相關(guān)報(bào)道。最近，云抗10號基因組[18]和舒茶早基因組[19]序列信息相繼釋放，使得PAE家族成員的鑒定、特性分析和功能研究更為容易和可靠。本研究采用生物信息學(xué)的方法開展了茶樹PAEs的鑒定、特性、進(jìn)化和亞細(xì)胞定位分析，以期為解析PAE在茶樹葉片氟富集和解毒過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)原料：采取湖北省茶樹資源圃中鄂茶1號一年生扦插苗一芽二葉，自來水沖洗擦干、液氮速凍后保存于–80℃?zhèn)溆谩?/p>

數(shù)據(jù)庫：舒茶早（var. sinensis cv ‘Shuchazao’）基因組數(shù)據(jù)庫[19]和三代測序數(shù)據(jù)（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)韋朝領(lǐng)老師提供）及鄂茶1號轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[20]。

試驗(yàn)藥劑：植物多糖多酚RNA提取試劑盒、零背景pTOPO-Blunt平末端克隆試劑盒購置于北京艾德萊生物科技有限公司；RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒購置于美國Thermo Scientific；TOYOBO高保真酶KOD plus購置于日本東洋紡（上海）生物科技有限公司；膠回收試劑盒購置于杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司；Taq酶購置于大連寶生物工程有限公司；引物合成、樣品測序由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成；其他生化試劑均購置于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

茶樹PAEs基本特性分析使用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam），保守結(jié)構(gòu)域分析使用NCBI CDD工具（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi）。多重序列比對使用CLUSTALW（https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）。信號肽分析使用SignalP5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP）。亞細(xì)胞定位預(yù)測使用TargetP 1.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）、WoLFPSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）和Loctree3（https://rostlab.org/services/loctree3）。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析使用TMHMM Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）。核和過氧化物酶體定位分析分別使用cNLS Mapper（http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）和PTS1 predictor（http://mendel.imp.ac.at/pts1）。使用MEGA X軟件采用NJ（Neighbor-Joining）法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.2 RNA提取、cDNA逆轉(zhuǎn)錄及CsPAEs克隆

以鄂茶1號一芽二葉為材料，使用植物多糖多酚RNA提取試劑盒提取總RNA，使用RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒獲得總cDNA。

以基因組中TEA020946、三代測序獲得的Tea_472383及鄂茶1號轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中Unigene0148795序列為參照，根據(jù)重復(fù)部分拼接PAE9并以此為模板設(shè)計(jì)引物。前置和后置引物分別為：5'-ATGATGAATAGAAGAAAAATTGAGTT-3'和5'-TCAGCCTATCAAGTTATGGCA-3'。同時，以基因組中TEA033219及鄂茶1號轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中Unigene0147524序列為參照設(shè)計(jì)PAE12引物，前置和后置引物分別為5'-ATGAGGAAGCTGATGGG-3'和5'-TTATTTGAAAACCAGATTGT-3'。隨后，使用TOYOBO高保真酶KOD plus克隆得到目的條帶，繼而使用膠回收試劑盒回收，零背景pTOPO-Blunt平末端克隆試劑盒連接、轉(zhuǎn)化DH5α，最后通過菌落PCR和測序驗(yàn)證。試驗(yàn)均參照相應(yīng)試驗(yàn)盒說明書操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹PAE家族成員的鑒定

使用PAE保守結(jié)構(gòu)域（pfam03283），在舒茶早基因組和三代測序數(shù)據(jù)中檢索到26個蛋白。為了排除重復(fù)，使用CLUSTALW對26個蛋白進(jìn)行了多重序列比對。結(jié)果表明，Tea_42986與Tea_50692序列相似性100%，TEA022428與Tea_38789序列相似性100%。隨后，為了進(jìn)一步驗(yàn)證，使用NCBI conserved domain database對余下的24個蛋白進(jìn)行了保守結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果表明，24個蛋白都是PAE超家族蛋白，其中16個蛋白是PAE；16個PAE蛋白中，10個蛋白的結(jié)構(gòu)域序列完整，5個蛋白的結(jié)構(gòu)域C端序列缺失，1個蛋白的結(jié)構(gòu)域N端序列缺失。蛋白結(jié)構(gòu)域序列缺失可能是測序或拼接不完全造成的，因此后續(xù)分析排除結(jié)構(gòu)域序列不完整的6個PAEs。綜上，在舒茶早基因組和三代測序數(shù)據(jù)中篩選到10個可能的PAE蛋白。

為了區(qū)分10個茶樹PAEs，使用CLUSTALW軟件將其與12個擬南芥PAEs（AtPAE1-12）進(jìn)行了多重序列比對。結(jié)果表明，2個蛋白包括TEA023839和Tea_32472同AtPAE5相似性最高，氨基酸同源性分別為49.7%和60.8%；4個蛋白包括TEA023165、TEA022428、Tea_23392和Tea_42986同AtPAE8相似性最高，同源性為64.2%~67.6%；Tea_47238同AtPAE9相似性最高，同源性為66.6%；2個蛋白包括TEA009391和 TEA002398與AtPAE10相似性最高，同源性分別為61.4%和57.7%；TEA033219同AtPAE12相似性最高，同源性為63.5%（表1）。由此可初步推測，茶樹中可能存在5個PAE成員，分別是PAE5、PAE8、PAE9、PAE10和PAE12。

2.2 茶樹PAEs保守基序分析

Philippe等[5]對72個植物PAEs分析發(fā)現(xiàn)，PAEs具有CLDG、PxYh、gGxwC、GS、Nwn、rYCDg、GCSxG、NxayDxwQ、HCQ等9個保守基序（圖1-A）。其中，HCQ是最保守的基序，GCSxG和NxayDxwQ也是重要的保守基序。為了驗(yàn)證茶樹PAEs保守基序，使用ClustalX2.1對10個PAEs和12個擬南芥PAEs進(jìn)行了多重序列比對。結(jié)果表明，茶樹中存在有CLDG、PxYH、GGGWC、GS、NWN、rYCDG、GCSAG、NaAYDSWQ、HCQ等9個保守基序（圖1-B）。同時，我們也發(fā)現(xiàn)僅有6個蛋白包括Tea_32472（PAE5）、TEA022428（PAE8）、Tea_23392（PAE8）、Tea_42986（PAE8）、TEA002398（PAE10）和TEA009391（PAE10）具有全部保守基序；TEA023165（PAE8）和TEA023839（PAE5）缺少中間的保守基序NaAYDSWQ；TEA0332199（PAE12）缺少N端的保守基序CLDG和PxYH，而Tea_47238（PAE9）缺少C端的保守基序HCQ（圖1-C）。蛋白保守基序的缺失尤其是N端和C端保守基序的缺失，可能源于基因的選擇性剪切，也可能是測序或拼接不完全造成的。

2.3 茶樹PAEs的克隆和命名

為了驗(yàn)證和進(jìn)一步分析，我們以鄂茶1號葉片cDNA為模板，以拼接的和設(shè)計(jì)全長引物，采用PCR對和進(jìn)行了擴(kuò)增，擴(kuò)增得到了符合預(yù)期大小的單一條帶（圖2-A）?；厥諚l帶后進(jìn)行了測序，測序結(jié)果表明，和大小分別為1191?bp和1?251?bp，與預(yù)期大小完全一致，分別命名為和（表1）。隨后，對ClCsPAE9和ClCsPAE12進(jìn)行了保守基序分析，發(fā)現(xiàn)二者均具有CLDG、PxYH、GGGWC、GS、NWN、rYCDG、GCSAG、NaAYDSWQ和HCQ 9個保守基序（圖1-C）。

網(wǎng)絡(luò)教學(xué)平臺不僅僅只是為教師組織教學(xué)提供了教學(xué)平臺，更重要的是為學(xué)生提供了一個巨大的資源庫。大部分的網(wǎng)絡(luò)教學(xué)平臺都有功能支持教師與學(xué)生的互動交流，從而有效地?cái)U(kuò)展了我們的教學(xué)空間。教師也可以從平臺的資源庫中調(diào)取各種學(xué)習(xí)資源，尤其是可以從一些精品課程中獲取各種適用的資料用于教學(xué)。

通過多重序列比對，我們發(fā)現(xiàn)TEA033219與ClCsPAE12相似性96.8%（圖2-B），Tea_47238與ClCsPAE9相似性100%（圖2-C），推測TEA033219是ClCsPAE12的亞型，Tea_47238是ClCsPAE9的亞型，是由基因可變剪切引起的。同樣地，TEA023165與Tea_42986（PAE8）相似性96.7%，Tea_23392與Tea_42986（PAE8）相似性97.3%，推測TEA023165和Tea_23392均是Tea_42986的亞型，是基因不同可變剪切類型造成的。此外，TEA023839與Tea_32472（PAE5）相似性85.2%，TEA002398和TEA009391（PAE10）相似性81.0%，且二者局部序列完全相同，推測也是選擇性剪切形成的不同蛋白。相關(guān)推測有待通過試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

注：A: 72個植物PAEs的保守基序，B、C：12個茶樹PAEs保守基序

至于Tea_42986（PAE8）與TEA022428（PAE8）二者相似性為82.9%，是2個不同的PAEs。由于Tea_42986與AtPAE8相似性高于TEA022428與AtPAE8的相似性，因此將Tea_42986命名為CsPAE8，TEA022428命名為CsPAE8-like。

綜上，我們在茶樹中共鑒定了12個PAE蛋白包括CsPAE5（Tea_32472）及亞型CsPAE5-1（TEA023839）、CsPAE8（Tea_429862）及亞型CsPAE8-1（Tea_23392）和CsPAE8-2（TEA023165）、CsPAE8-like（TEA022428)、CsPAE9（ClCsPAE9）及亞型CsPAE9-1（Tea_47238）、CsPAE10（TEA002398）及亞型CsPAE10-1（TEA009391）和CsPAE12（ClCsPAE12）及亞型CsPAE12-1（TEA033219）（表1）。

2.4 茶樹PAE進(jìn)化樹分析

為了了解茶樹PAEs同其他植物的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA X構(gòu)建了69個植物PAEs的進(jìn)化樹。69個植物PAEs分別是：水稻（）7個、二穗短柄草（）6個、高梁（）6個、擬南芥（）12個、大豆（）7個、番茄（）7個、葡萄（）5個、楊樹（）8個、可可（）6個和茶樹（）5個。進(jìn)化樹表明（圖3），69個植物PAEs被聚為了4組，一組包括6個PAEs，PAE1、PAE2、PAE3、PAE6、PAE10和PAE12；二組包括PAE7、PAE8和PAE11；三組包括PAE4和PAE5；第四組僅包括1個PAE9。5個茶樹PAEs包括CsPAE5、CsPAE8、CsPAE9、CsPAE10和CsPAE12分別聚到了相應(yīng)組，并且在距離上同可可、葡萄PAEs較近，同單子葉植物（水稻和二穗短柄草）PAEs較遠(yuǎn)。此外，同一亞組的單子葉植物PAEs明顯地聚在了一起。

圖2 CsPAE9和CsPAE12的克?。ˋ）及蛋白比對（B、C）

Fig. 2The cloning ofand(A), and protein blast (B, C)

注：M：線粒體；S：分泌蛋白；Ch：葉綠體；V：液泡；Cy：細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)；Ex：胞外基質(zhì)?！?”表示預(yù)測結(jié)果相同

Notes:M: Mitochondria. S: Secretory protein. Ch: Chloroplast. V: Vacuole. Cy: Cytoplasmic matrix. Ex: Extracellular matrix. “*” indicate same predicted results

2.5 茶樹PAE蛋白基本特性分析和亞細(xì)胞定位分析

使用在線ProtParam 軟件（https://web.expasy.org/protparam）對茶樹PAEs進(jìn)行了分析。12個CsPAEs氨基酸平均大小為395，變化范圍為326~515；蛋白分子量和等電點(diǎn)分別為36.7~56.9?kDa和5.1~8.9（表1），與擬南芥的氨基酸平均大小413，變化范圍326~451、蛋白分子量和等電點(diǎn)分別為39~49?kDa和5.7~9.4基本一致。

信號肽是新合成肽鏈中指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移的一段N端序列，一般由15~30個氨基酸組成，是新生蛋白分泌到胞外的信號。信號肽預(yù)測結(jié)果表明，12個CsPAEs中，除CsPAE5、CsPAE5-1和CsPAE10-1不具有N端信號肽外，其他9個CsPAEs具N端信號肽，大小為19~24個氨基酸，是分泌蛋白（表1）。令人疑惑地是，CsPAE10具N端信號肽，而CsPAE10-1不具有N信號肽。

亞細(xì)胞定位是某種蛋白在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位，蛋白的亞細(xì)胞定位分析有助于蛋白功能的初步判斷。我們使用TargetP、LOCtree 和Wolf軟件對12個CsPAEs進(jìn)行了亞細(xì)胞定位預(yù)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個CsPAEs 3種預(yù)測結(jié)果相同，7個CsPAEs 2種預(yù)測結(jié)果相同，僅CsPAE10-1 3種預(yù)測結(jié)果均不同，推測CsPAE5、CsPAE5-1定位于線粒體，9個具N端信號肽的蛋白包括CsPAE8、CsPAE8-1、CsPAE8-2、CsPAE8-like、CsPAE9、CsPAE9-1、CsPAE10、CsPAE12及CsPAE12-1是分泌蛋白，定位于細(xì)胞壁。值的提及地是，CsPAE10-1使用TargetP未定位于線粒體、葉綠體、胞外且另外兩種預(yù)測結(jié)果不同，無法預(yù)測定位。隨后，使用核定位軟件cNLS Mapper（http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）、過氧化物酶體定位信號PTS1預(yù)測器（http://mendel.imp.ac.at/pts1）、跨膜螺旋預(yù)測軟件TMHMM Server （http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM）對CsPAE10-1進(jìn)行了進(jìn)一步分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CsPAE10-1無跨膜螺旋、無核和過氧化物酶體定位信號，因此推測其為細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)蛋白，結(jié)果尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，跨膜預(yù)測結(jié)果表明，CsPAE5、CsPAE5-1、CsPAE12和CsPAE12-1具有1~2個跨膜螺旋，是跨膜蛋白，這與Philippe等[5]報(bào)道的擬南芥PAEs沒有跨膜蛋白結(jié)果并不相符。

圖3 10個植物的69個PAEs進(jìn)化樹

sFig. 3Phylogenetic tree of 69 PAEs from 10 plantspecies

3 討論

果膠是植物細(xì)胞壁的重要組成成分之一，在其從高爾基體向胞外泌出的過程中常發(fā)生乙?；揎?，其乙酰化的程度受切割乙酰酯鍵的PAE的調(diào)控[7-8,11]。研究發(fā)現(xiàn)，PAE在植物生長發(fā)育、果實(shí)硬度和脅迫防御中具有重要作用[9,12,15-16]。

PAE是一個多基因家族，具有保守的PAE結(jié)構(gòu)域。使用PAE保守結(jié)構(gòu)域，在茶樹舒茶早基因組和三代數(shù)據(jù)中檢索到24個蛋白。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，24個蛋白中僅有10個PAEs結(jié)構(gòu)域序列完整，且10個中僅有6個源于基因組，表明基因組測序并不完全或序列注釋并不完整。為了進(jìn)一步分析，我們克隆了PAE9和PAE12 CDS全長。在茶樹中鑒定了12個PAEs，這和水稻10個、擬南芥12個、番茄13個、葡萄7個、楊樹14個、獼猴桃10個和可可14個PAEs的結(jié)果基本一致。經(jīng)過與擬南芥PAEs序列比對，初步推測12個茶樹PAEs屬于5個PAEs（成員），分別是PAE5、PAE8、PAE9、PAE10和PAE12。12個CsPAEs序列比對發(fā)現(xiàn)，5個PAEs均存在不同的亞型，表明PAE基因發(fā)生了可變剪切事件。

蛋白保守基序分析發(fā)現(xiàn)，CsPAEs具有CLDG、PxYH、GGGWC、GS、NWN、rYCDG、GCSAG、NaAYDSWQ、HCQ等共9個保守基序，較之于72個植物PAEs的保守基序CLDG、PxYh、gGxwC、GS、Nwn、rYCDg、GCSxG、NxayDxwQ和HCQ更為保守[5]，表明了茶樹PAEs的保守性及與其他植物的分化。69個植物PAEs的進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，不同物種同源PAEs明顯地聚在了一起，表明PAEs在不同物種間具有高度保守性；CsPAEs與同為木本植物的可可、葡萄進(jìn)化距離較近，表明它們間親緣關(guān)系較近。此外，亞組內(nèi)的單子葉植物PAEs聚在一起并與雙子葉植物PAEs明顯地分離，揭示了單子葉植物和雙子葉植物的分化。

12個CsPAEs亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，除CsPAE10-1定位外，其他11個CsPAEs的定位與擬南芥同源PAEs定位一致[5]，再次表明PAEs在不同的物種間具有高度的保守性，并且可能具有相同的生理生化功能。CsPAE8及亞型、CsPAE8-1ike、CsPAE9及亞型、CsPAE10-2、CsPAE12及亞型定位于細(xì)胞壁，表明它們在細(xì)胞壁執(zhí)行功能。通過序列比對，前期在茶樹葉片中鑒定到的響應(yīng)氟脅迫的PAE是PAE8-1ike。鑒于CsPAE8-1ike定位于細(xì)胞壁并在氟脅迫后表達(dá)上調(diào)，推測CsPAE8-1ike可能通過調(diào)控果膠去乙?；饔脜⑴c茶樹葉片細(xì)胞壁對氟富集和解毒。然而，具體功能的解析尚需進(jìn)一步深入研究。

綜上，本研究通過生物信息學(xué)的方法共鑒定了12個茶樹PAEs，并對它們進(jìn)行了命名、進(jìn)化分析、基本特性分析和亞細(xì)胞定位分析，以期為探討CsPAE在茶樹葉片氟富集和解毒過程中的功能提供研究基礎(chǔ)。

[1] Roberts K. How the cell wall acquired a cellular context [J]. Plant Physiology, 2001, 125(1): 127-130.

[2] Mohnen D. Pectin structure and biosynthesis [J]. Current Ppinion in Plant Biology, 2008, 11(3): 266-277.

[3] Caffall K H, Mohnen D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides [J]. Carbohydrate Research, 2009, 344(14): 1879-1900.

[4] Krzes?owska M. The cell wall in plant cell response to trace metals: polysaccharide remodeling and its role in defense strategy [J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2011, 33(1): 35-51.

[5] Philippe F, Pelloux J, Rayon C. Plant pectin acetylesterase structure and function: new insights from bioinformatics analysis [J]. BMC Genomics, 2017, 18 (1): 456. DOI: 10.1186/s12864-017-3833-0.

[6] Sengkhamparn N, Bakx E J, Verhoef R, et al. Okra pectin contains an unusual substitution of its rhamnosyl residues with acetyl and alpha-linked galactosyl groups [J]. Carbohydrate Research 2009, 344(14): 1842-1851.

[7] Buffetto F, Ropartz D, Zhang X J, et al. Recovery and fine structure variability of RGII sub-domains in wine () [J]. Annals of Botany, 2014, 114(6): 1327-1337.

[8] Scheller H V, Ulvskov P. Hemicelluloses [J]. Annual Review of Plant Biology, 2010, 61: 263-289.

[9] Gou J Y, Miller L M, Hou G C, et al. Acetylesterase-mediated deacetylation of pectin impairs cell elongation, pollen germination, and plant reproduction [J]. The Plant Cell, 2012(24): 50-65.

[10] Bonnin E, Clavurier K, Daniel S, et al. Pectin acetylesterases fromare able to deacetylate homogalacturonan as well as rhamnogalacturonan [J]. Carbohydrate Polymers, 2008, 74(3): 411-418.

[11] Orfila C, Dal Degan F, J?rgensen B, et al. Expression of mung bean pectin acetylesterase in potato tubers: effect on acetylation of cell wall polymers and tuber mechanical properties [J]. Planta, 2012, 236(1): 185-196.

[12] Matas A J, Rodríquez, V, Sánchez L, et al. Down-regulation of a pectin acetylesterase gene modifies strawberry fruit cell wall pectin structure and increases fruit firmness [J]. Current Research in Plant Physiology (XIV Congreso Hispano-Luso de Fisiología Vegetal), 2015, 1(1): 320.

[13] Vercauteren I, de Almeida Engler J, De Groodt R, et al. Anpectin acetylesterase gene is upregulated in nematode feeding sites induced by root-knot and cyst nematodes [J]. Moleculae Plant-Microbe Interactions, 2002, 15(4): 404-407.

[14] Pogorelko G, Lionetti V, Fursova O, et al. Arabidopsis andtransgenic plants expressingacetylesterases have decreased degree of polysaccharide acetylation and increased resistance to pathogens [J]. Plant Physiology, 2013, 162(1): 9-23.

[15] 楊志遠(yuǎn), 楊鋼, 曹華, 等. 果膠乙酰酯酶基因AtPae7參與擬南芥對大豆疫霉菌的非寄主抗病性[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(11): 1716-1722.

[16] Liu Y L, Cao D, Ma L L, et al. TMT-based quantitative proteomics analysis reveals the response ofto fluoride [J]. Journal of proteomics, 2018, 176: 71-81.

[17] Souza A J D, Pauly M. Comparative genomics of pectinacetylesterases: insight on function and biology [J]. Plant Signaling & Behavior, 2015, 10(9): e1055434. DOI: 10.1080/15592324.2015.1055434.

[18] Xia E H, Zhang H B, Sheng J, et al. The tea tree genome provides insights into tea flavor and independent evolution of caffeine biosynthesis [J]. Molecular Plant, 2017, 10 (6): 866-877.

[19] Wei C L, Yang H, Wang S B, et al. Draft genome sequence ofvar. sinensis provides insights into the evolution of the tea genome and tea quality [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2018, 115(18): E4151- E4151.

[20] Cao D, Liu Y L, Ma L L, et al. Transcriptome analysis of differentially expressed genes involved in selenium accumulation in tea plant () [J]. PLoS ONE, 2018, 13(6): e0197506. DOI: 10.1371/journal.pone.0197506.

Identification and Bioinformatic Analysis of Pectin Acetylesterases fromTea Plant

LIU Yanli, MA Linlong, CAO Dan, JIN Xiaofang*,FENG Lin, GONG Ziming

Institute of Fruit and Tea, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430209, China

Tea plant is a fluoride hyperaccumulator with high fluoride in leaves, which has many health benefits to human body. Tea pectin acetylesterase (PAE) may be related to fluoride accumulation and detoxification by regulating pectin deacytelation. However, few reports on tea PAEs were available. In the study, the identification and analysis of characteristic, evolutionary and subcellular localization of CsPAEs were performed by bioinformatics method based on tea genome database and three next-generation sequencing data ofvar. sinensis cv ‘Shuchazao’. The results indicate that 12 CsPAEs belonged to five members, including PAE5, PAE8, PAE9, PAE10 and PAE12. Nine conserved motifs including CLDG, PxYH, GGGWC, GS, NWN, rYCDg, GCSAG, NaAYDSWQ and HCQwere found in CsPAEs;CsPAEs were more closely related to PAEs ofandaccording toevolutionary relationship; Amino acid length, molecular weight and theoretical isoelectric point of 12 CsPAEs varies from 326-515, 36.7-56.9?kDa and 5.1-8.9, respectively. Except that CsPAE5 and CsPAE5-1 were predicated to be localized in the mitochondrion, and CsPAE10-1 might be present in cellular martix. The rest CsPAEs were predicated to be localized in the cell wall. CsPAE5, CsPAE5-1, CsPAE12 and CsPAE12-1 were transmembrane proteins. The results provided a foundation for functional analysis of CsPAEs involved in fluoride accumulation and detoxification.

tea plant (), pectin acetylesterase, identification, bioinformatics analysis

S571.1；S154.1

A

1000-369X(2019)05-521-09

2019-03-28

2019-04-23

湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科學(xué)基金項(xiàng)目（2017NKYJJ05）、湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項(xiàng)目（2016-620-000-001-032）

劉艷麗，女，博士，主要從事茶樹栽培育種與生物技術(shù)研究。*通信作者：jxf1130@126.com