林士佳，李輝，劉昊，滕瑞敏，劉婧愉，王爽，莊靜

茶樹基因的克隆與非生物脅迫響應分析

林士佳，李輝，劉昊，滕瑞敏，劉婧愉，王爽，莊靜*

南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，茶葉科學研究所，江蘇 南京 210095

基于茶樹轉錄組數(shù)據(jù)，以龍井43茶樹cDNA為模板，克隆得到開放閱讀框（ORF）長度為1?305?bp，編碼434個氨基酸的茶樹單脫氫抗壞血酸還原酶基因，命名為。蛋白序列特征和基因表達模式分析表明，CsMDHAR蛋白含有FAD結合功能域，屬于FAD依賴的吡啶核苷酸-硫基氧化還原酶（Pyr-redox-2）家族。該蛋白有兩個無序化區(qū)域，而且包含有32個磷酸化位點，理論相對分子量為47.21?kDa，為5.99，屬于親水性蛋白；CsMDHAR蛋白二級結構以α-螺旋和隨機卷曲為主。通過PlantCARE和PLACE對啟動子上游調控元件進行分析預測，結果顯示，基因啟動子上游1?000?bp中含有多個與光、激素以及植物抗逆有關的順式作用元件。利用熒光定量PCR方法檢測龍井43和迎霜的、和在4種不同非生物脅迫下的表達水平，結果表明，在低溫（4℃）脅迫下，兩個茶樹品種的、和的表達均受抑制，且品種間的差異較?。辉诟邷兀?8℃）和干旱（200?g·L-1PEG）脅迫下龍井43中的表達均上調，分別在8?h和2?h時達到最大值，為對照的1.49倍和1.85倍；鹽（200?mmol·L-1NaCl）脅迫下，和在兩種茶樹品種中的表達量變化趨勢相似，但變化幅度不同，可能與品種間不同的抗逆性有關。

茶樹；；抗壞血酸；非生物脅迫；啟動子元件分析；表達分析

茶樹[(L.) O. Kuntze]作為葉用植物，含有豐富的茶多酚、茶多糖、抗壞血酸等成分，經(jīng)常飲茶不僅可以提高機體的抗衰老、抗氧化能力，同時對解油膩、消食利尿也有較好的作用[1]。在自然生長發(fā)育過程中，茶樹會受到不同環(huán)境條件（高低溫、干旱和高鹽等）的侵害，從而影響茶葉的產(chǎn)量和品質[2]。環(huán)境脅迫會導致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）在細胞內大量積累，引起氧化脅迫，危害植物個體的生長和發(fā)育，甚至導致植株死亡[3-4]。

抗壞血酸（L-ascorbic acid，AsA），即維生素C（Vc），是一種廣泛存在于植物體內的高豐度抗氧化物質，直接參與清除逆境脅迫下植物體內產(chǎn)生的過量活性氧[5-6]。人為提高植株的AsA含量，可提高對氧化脅迫的抵抗力，以及對其他逆境環(huán)境的抗性[7-9]。AsA的代謝主要是通過植物抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)途徑（圖1），AsA由抗壞血酸氧化酶（Ascorbate oxidase，AO）和抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）氧化AsA生成單脫氫抗壞血酸（Monodehydroascorbate，MDHA），而單脫氫抗壞血酸還原酶（Monodehydroascobate reductase，MDHAR）又將MDHA還原生成AsA，從而調節(jié)植物AsA含量的動態(tài)平衡。因此，MDHAR對AsA的代謝及植物抗逆起著積極作用。百合受氧化（H2O2）脅迫誘導而表達[10]，表明在植物清除逆境產(chǎn)生的ROS方面起著重要作用。番茄在莖和葉片等營養(yǎng)器官中表達較高，有利于其在環(huán)境脅迫條件下維持低水平的抗壞血酸氧化還原狀態(tài)，控制體內的ROS含量[11]；過量表達的轉基因番茄植株，MDHAR活性和AsA含量增大，提高植株的抗逆性[12]。此外，還參與了小麥的超敏（Hypersensitive respond，HR）反應，在小麥與條銹病互作中發(fā)揮重要作用[13]。

注：APX：抗壞血酸過氧化物酶；AO：抗壞血酸氧化酶；MDHAR：單脫氫抗壞血酸還原酶；DHAR：脫氫抗壞血酸還原酶；GR：谷胱甘肽還原酶

目前，李佼[14]已克隆出了5個茶樹AsA合成相關酶基因。龐磊[15]研究發(fā)現(xiàn)，茶樹基因家族參與了茶樹抗寒和抗旱調控機制。其中細胞質型（）能夠受低溫誘導顯著上調，但被干旱所抑制。相對茶樹其他抗壞血酸代謝相關酶基因的研究，的表達及其對逆境的響應研究尚未見報道。本文以龍井43為材料，克隆獲得茶樹基因，并對其序列、理化性質和蛋白結構等方面進行了分析，同時通過熒光定量PCR技術，檢測了在龍井43和迎霜兩個茶樹品種中對4種非生物逆境（4℃、38℃、200?g·L-1PEG、200?mmol·L-1NaCl）脅迫的響應，并且檢測了AsA循環(huán)再生途徑中另外兩個關鍵酶和對4種非生物逆境脅迫的響應，為進一步研究在茶樹中的生物學功能以及茶樹抗壞血酸代謝循環(huán)提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為種植于南京農(nóng)業(yè)大學茶葉科學研究所的兩年生扦插盆栽幼苗龍井43。取龍井43幼嫩葉片，提取總RNA反轉錄為cDNA作為克隆模板。

另取生理狀態(tài)相似且健康的龍井43和迎霜茶樹植株分別進行低溫（4℃）、高溫（38℃）、干旱（200?g·L-1PEG）、高鹽（200?mmol·L-1NaCl）處理，在0、2、8?h和24?h取樣。對上述所得的處理樣品，提取RNA后反轉錄成cDNA，作為實時熒光定量模板，3次生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成

參照Quick RNA Isolation Kit（北京華越洋公司）試劑盒說明書提取茶樹材料的總RNA，使用Nanodrop ND 1000（上海譜元儀器有限公司）微量紫外分光光度計檢測RNA樣品濃度，RNA質量通過1.2%凝膠電泳檢測?？俁NA反轉錄為cDNA按照Prime Script RT reagent Kit（大連TaKaRa公司）試劑盒說明書操作。

1.2.2 茶樹基因克隆

基于本課題組茶樹轉錄組數(shù)據(jù)[16]，設計1對特異引物CsMDHAR-F（5'-ATGGCGGAGA AGACTTTCAAG-3'）和CsMDHAR-R（5'-TCA AATCTTGCAGGCAAAGGTGA-3'）。PCR擴增體系為20?μL，包括2×Plus Master Mix酶10?μL，ddH2O 7?μL，模板cDNA 1?μL和CsMDHAR-F/R引物各1?μL。反應條件為95℃ 5?min；95℃ 30?s，55℃ 30?s，72℃ 60?s，35個循環(huán)；72℃延伸10?min。采用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物后連接至pMD19-T載體上，然后轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞，最后經(jīng)篩選抽提質粒后送至南京金瑞斯生物科技有限公司進行測序。

1.2.3 茶樹序列及啟動子序列分析

在NCBI網(wǎng)站（http://blast.ncbi.nlm.nih. gov /Blast.cgi）上，對獲得的核苷酸和蛋白質序列進行BLAST和保守域預測。多重氨基酸序列比對選擇DNAMAN 6.0軟件（Lynnon公司）。利用MEGA 7.0[17]完成系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。氨基酸的組成及其理化性質分析采用在線工具包SMS（http://www.bio-soft.net/sms）和ExPASy-ProtParam（http://web.expasy.org/protparam）。氨基酸序列磷酸化位點和折疊無序化分析使用在線軟件NetPhos和FoldIndex完成。蛋白質二級結構和三維結構預測分別在SOPMA和Swiss-Model上進行。通過茶樹基因組數(shù)據(jù)庫TPIA（http://tpia.teaplant.org）和TBtools軟件獲取起始密碼子上游1?000?bp序列，再利用在線分析網(wǎng)站RegSite Plant DB對啟動子序列進行分析預測。利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）和PLACE（https://sogo.dna.affrc. go.jp）對該基因起始密碼子前1?000?bp的序列進行順式作用元件分析。

1.2.4 茶樹基因的表達分析

2 結果與分析

2.1 CsMDHAR基因的克隆

提取二年生龍井43扦插苗嫩葉的RNA，并反轉錄為cDNA。然后以CsMDHAR-F和CsMDHAR-R為引物進行PCR擴增，最后對擴增片段進行測序。本文克隆得到的基因序列已登錄GenBank，登錄號為MN402504，該基因共編碼434個氨基酸，ORF長度為1?305?bp。

2.2 CsMDHAR進化樹分析和氨基酸序列比對

為探究茶樹CsMDHAR的進化關系，選取擬南芥（）、葡萄（）、蘋果（）等15個物種的MDHAR氨基酸序列，與茶樹CsMDHAR氨基酸序列構建同源進化樹。結果表明，茶樹CsMDHAR氨基酸序列與獼猴桃（）、小果咖啡（）等物種的進化關系較近，與大豆（）、豌豆（）等物種的進化關系較遠（圖2）。對茶樹CsMDHAR氨基酸序列保守域預測發(fā)現(xiàn)，CsMDHAR蛋白在6~322個氨基酸位點之間含有FAD結合功能域，屬于FAD依賴的吡啶核苷酸-硫基氧化還原酶（Pyr-redox-2）家族（圖3-A）。將茶樹CsMDHAR同擬南芥、葡萄等7個物種的MDHAR氨基酸序列進行多序列比對，結果顯示一致性達89.91%（圖3-B）。上述物種MDHAR蛋白序列均存在兩個保守的指紋序列，這兩個指紋序列涉及到與FAD或NAD（P）H的ADP結合；另外，還存在1個與FAD的黃素部分結合相關的結構域。

圖2 茶樹CsMDHAR蛋白的進化樹分析

2.3 CsMDHAR蛋白氨基酸的理化性質及無序化結構分析

運用ExPASy-ProtParam[21]在線工具包對茶樹、擬南芥、葡萄等16個物種MDHAR蛋白的組成成分和理化性質進行分析。結果如表1所示，上述物種的MDHAR蛋白氨基酸殘基數(shù)為433或434，相對分子量在46.49~47.31?kDa。理論等電點為5.5~6.9。脂肪族氨基酸（23%）明顯高于芳香族氨基酸（10%），酸性氨基酸占比為13%，堿性氨基酸占比為12%。總平均疏水性（Grand average of hydropathicity）均為負值，表明MDHAR蛋白屬于親水性蛋白。利用NetPhos在線軟件對CsMDHAR蛋白的磷酸化位點預測，結果顯示，CsMDHAR含有12個蘇氨酸（T）磷酸化位點，11個絲氨酸（S）磷酸化位點，9個酪氨酸（Y）磷酸化位點。運用FoldIndex對茶樹CsMDHAR蛋白氨基酸序列進行折疊的無序化分析，結果表明CsMDHAR中共有2個無序化區(qū)域，無序化比例為4.38%；總體而言CsMDHAR無序化不明顯（圖4）。

注：‘—’代表與FAD的ADP結合的指紋序列；‘··’代表與NAD（P）H的ADP結合的指紋序列；‘—·’代表與FAD的黃素基團相結合的氨基酸基序

2.4 茶樹CsMDHAR蛋白推導的二級結構及三維結構預測分析

為了進一步研究CsMDHAR蛋白，利用SOPMA網(wǎng)站進行茶樹CsMDHAR蛋白二級結構的預測與分析。如圖5所示，不規(guī)則卷曲是CsMDHAR的主要組成部分，占比為38.25%；而α-螺旋為27.19%，β-折疊為25.81%，β-轉角為8.76%。對CsMDHAR三級結構預測結果如圖6，其三維結構推測與二級結構吻合，不規(guī)則卷曲占了蛋白質結構的大部分區(qū)域，α-螺旋和β-折疊分散其中。

表1 不同植物中MDHAR氨基酸組成成分及理化性質分析

Table 1 Comparison of composition and chemical characterization of amino acid sequencesof MDHAR among different plants

圖4 茶樹CsMDHAR折疊狀態(tài)分析

注：藍色：α-螺旋；紅色：β-折疊；綠色：β-轉角；粉色：不規(guī)則卷曲

圖6 茶樹CsMDHAR三維結構預測

2.5 CsMDHAR基因啟動子預測與分析

利用在線網(wǎng)站TPIA和TBtools軟件檢索到起始密碼子上游1?000?bp序列，再通過RegSite Plant DB對其啟動子進行預測。結果表明，的轉錄起始位點位于ATG上游–108?bp，Enhancer位于ATG上游–83?bp，該基因上游–129?bp處有一個TATA-box。為了進一步了解的表達模式，本研究通過PlantCARE數(shù)據(jù)庫和PLACE數(shù)據(jù)庫對啟動子上游調控元件進行比較分析。如表2所示，除順式元件CAAT-box和TATA-box外，還預測到了光響應元件CACTFTPPCA1、G-Box，熱激響應元件CCAAT-box，ABA響應元件EBOXBNNAPA，干旱響應元件MYBCORE、MYB2CONSENSUSAT以及低溫響應元件MYCCONSENSUSAT。

2.6 茶樹CsMDHAR對非生物脅迫的響應

通過實時熒光定量PCR，檢測在茶樹品種龍井43和迎霜中在經(jīng)過低溫（4℃）、高溫（38℃）、干旱（200?g·L-1PEG）、高鹽（200?mmol·L-1NaCl）4種非生物脅迫下的表達水平（圖7）。結果表明，在上述4種非生物脅迫條件下均被誘導表達，但其相對表達量在不同脅迫處理和脅迫時間下存在差異。低溫脅迫下，在龍井43和迎霜中的表達趨勢均為先下降后升高，分別在2?h和8?h時達到最小值，與對照相比減少了75%和45%，基因的表達在低溫處理下品種差異不顯著（圖7-A）。高溫脅迫下，在龍井43中的表達量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在迎霜中的表達則相反；該基因的表達在38℃處理2?h和8?h時，品種差異顯著（圖7-B）。干旱脅迫下，在兩個茶樹品種中的表達差異顯著，其表達量在龍井43中先增后減，在各個處理時間下的表達量均顯著高于對照組，且在2?h時最高，為對照組的1.85倍；而基因在迎霜中一直處于相對較低水平，在2?h時達到最低值，表達量比對照降低了75%（圖7-C）。200?mmol·L-1NaCl處理時，龍井43的基因在2?h和8?h時的表達量顯著低于對照，而在24?h時的表達量急劇升高，為對照的2.42倍，迎霜中表達顯著下降，在8?h時達到最小值（圖7-D）。

表2 CsMDHAR啟動子區(qū)域的順式元件及其功能

注：A、B、C和D分別代表4℃、38℃、PEG和NaCl脅迫處理。不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著

2.7 茶樹CsAO和CsAPX對非生物脅迫的響應

植物體內抗壞血酸循環(huán)代謝途徑涉及多個酶，基因編碼的單脫氫抗壞血酸還原酶是關鍵酶之一，AO和APX在該循環(huán)途徑中也發(fā)揮重要作用[12]。為了進一步研究茶樹中抗壞血酸的代謝循環(huán)，通過熒光定量PCR檢測了和在4種非生物逆境脅迫的表達水平。低溫脅迫下（圖8-A），龍井43和迎霜的和表達量變化規(guī)律一致，的表達先下調后上調，且均在2?h達到最小值，而的表達量隨著處理時間的延長逐漸降低。高溫處理下（圖8-B），龍井43中的和一直處于較低水平，在8?h時達最低，與對照相比分別降低了82%和90%。迎霜中表達水平顯著上調，在24?h時最高，為對照的6.49倍，迎霜中在2?h和24?h時表達相對較低，而在8?h表達水平顯著提高，為對照的2.92倍。在干旱脅迫下（圖8-C），迎霜品種的表達模式與高溫脅迫的相似，先下調后上調然后再下調，在8?h時最高，為對照的1.21倍，而龍井43的表達較低；龍井43的在8?h時表達顯著增加，為對照的6.35倍，迎霜的表達水平則隨著處理時間的延長而增加。高溫和干旱均能誘導表達，且該基因在兩個品種中的表達差異顯著。高鹽脅迫下（圖8-D），兩個品種的表達量變化規(guī)律一致，先升后降，均在2?h達到最高峰。而對于，在龍井43中其表達水平下降，在迎霜中，其表達趨勢為先下調后上調，在2?h時達最低，表達量比對照減少了76%。

3 討論

AsA能直接清除植物體內逆境脅迫下產(chǎn)生的過量活性氧，減少其對機體的傷害，是一種高豐度抗氧化物質。而MDHAR作為AsA再生的關鍵酶，能以NADPH為電子供體，將由AsA氧化生成的MDHA催化還原為AsA，從而對AsA的代謝及植物抗逆均有重要作用[22]。本文從茶樹龍井43中克隆獲得茶樹基因，該基因共編碼了434個氨基酸，其ORF長度為1?305?bp。保守域預測分析顯示CsMDHAR蛋白含有FAD結合功能域，屬于依賴FAD的吡啶核苷酸-硫基氧化還原酶（Pyr-redox-2）家族[23]。CsMDHAR存在兩個與FAD或NAD（P）H的ADP結合相關的指紋序列，以及與FAD的黃素部分結合有關的結構域。水稻OsMDHAR的結構與催化機制研究表明，Arg320和Tyr349殘基對其活性至關重要，其中Arg320殘基的作用是與主要的底物結合，而Tyr349殘基通過FAD介導電子從NAD（P）H到結合底物的轉移[24]。

注：A、B、C和D分別代表4℃、38℃、PEG和NaCl脅迫處理。不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著

基因表達活性受到其啟動子區(qū)域的順式元件與相應的反式作用因子的調控，因此，處于基因啟動子區(qū)域的DNA順式元件在基因的表達中發(fā)揮著重要作用。為了初步了解茶樹的基因功能，本文對啟動子區(qū)順式作用元件進行了分析，結果發(fā)現(xiàn)基因啟動子上除了含有典型的順式作用元件CAAT-box、TATA-box外，還含有CACTFTPPCA1、CCAAT-box、EBOXBNNAPA和MYBCORE等與信號傳遞途徑相關以及植物抗逆相關的順式作用元件，推測該基因可能參與茶樹的激素調控和環(huán)境脅迫應答[25-26]。

在逆境脅迫下，植物通過啟動自身的抗氧化系統(tǒng)包括增加抗氧化酶活性和非酶抗氧化劑含量（如AsA）來清除體內多余的ROS，從而保護自身不受逆境損傷[10-11]。本研究選用龍井43和迎霜兩個茶樹材料，驗證了抗壞血酸循環(huán)代謝途徑中關鍵酶基因、和對低溫、高溫、干旱和鹽脅迫下的響應。結果顯示，4℃處理抑制了的表達，各個處理時間的表達量顯著低于對照，且在兩個茶樹品種間的表達不存在差異。草莓在低溫脅迫下的轉錄水平增加[27]，表明低溫對的誘導表達在不同物種間存在差異。在高溫和干旱脅迫下的表達模式相近，其轉錄水平顯著增加，這與馬玉華的研究結果類似[28]。NaCl處理下，兩種茶樹和表達量變化趨勢相似，但變化幅度不同，可能與品種間不同的抗逆性有關。大量研究表明，不論是抑制番茄或基因的表達，還是過量表達，均能促進番茄果實抗壞血酸的積累，提高植株的抗逆性[22,29-30]。在鹽脅迫下，植物可能通過改變AsA的氧化還原狀態(tài)來增強自身的抗逆能力，在茶樹龍井43中，和的表達量變化趨勢完全相反，而的表達量變化處于較穩(wěn)定的被抑制狀態(tài)，說明和在鹽脅迫下對于維持茶樹體內AsA的含量可能發(fā)揮相對較大的作用。

本文克隆了基因并分析了其在不同逆境處理下的表達情況，同時還分析了和對逆境的響應，初步推測基因在保護植物自身不受脅迫傷害方面發(fā)揮了一定的功能，但其在茶樹中可能存在的作用機制仍待進一步深入研究。

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Cloning and Response Analysis of theGene Under the Abiotic Stress in

LIN Shijia, LI Hui, LIU Hao, TENG Ruimin, LIU Jingyu, WANG Shuang, ZHUANG Jing*

Tea Science Research Institute, College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

In this study, agene () was cloned fromcv. ‘Longjing 43’ based on the transcriptome data of tea plant. Sequence analysis shows that the open reading frame length ofwas 1?305?bp, encoding 434 amino acids with a molecular weight of approximately 47.21?kDa and the theoretical isoelectric point of 5.99. CsMDHAR was a hydrophilic protein, including two unordered regions and 32 phosphorylation sites. CsMDHAR belonged to Pyr-redox-2 super-family containing a highly conserved region called FAD domain, and mainly composed of α-helix and random coil. PlantCARE and PLACE database prediction analysis suggest that there were many-elements related to light, hormones and stress resistance in the 1?000?bp upstream region ofgene. The expression profiles of,andin tea cv ‘Longjing 43’ and ‘Yingshuang’ under high temperature, low temperature, drought, and salt treatments were detected by qRT-PCR. The results indicate that the expression profiles of,andwere suppressed under 4℃, and there were no significantly differences in ‘Longjing 43’ and ‘Yingshuang’. However, the expression profiles ofgene were upregulated under 38℃ or 200?g·L-1PEG treatments in ‘Longjing 43’, with the highest 2.5 and 5 times of the control at 8?h and 2?h, respectively. In addition, the expression trends ofandin both cultivars were similar under NaCl (200?mmol·L-1) treatment, but the variation ranges were different, which might be related to the different stress response in tea plant.

,, ascorbic acid, abiotic stress, promoter analysis, expression analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2019)05-495-11

2019-05-08

2019-07-12

國家自然科學基金（31570691、31870681）

林士佳，女，碩士研究生，主要從事茶樹遺傳育種研究，E-mail: 2018104088@njau.edu.cn。*通信作者：zhuangjing@njau.edu.cn