朱明新 李志強(qiáng) 任長(zhǎng)洪

(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，臺(tái)州 318000)

莽草酸(Shikimic acid, 圖1)首次由Eykman于1885年從八角科植物的干燥成熟果實(shí)中提取得到[1]。

莽草酸能夠通過(guò)影響花生四烯酸代謝，起到抑制血小板聚集、動(dòng)靜脈血栓及腦血栓形成的作用[2]。莽草酸還具有消炎、鎮(zhèn)痛的功能，是許多抗癌藥物的中間體[3-6]。莽草酸還是明星藥物“達(dá)菲”即磷酸奧司他韋合成的關(guān)鍵中間體[7]。磷酸奧司他韋是目前WHO藥物清單推薦用于重癥流感患者治療的唯一可選擇藥物，長(zhǎng)期被公認(rèn)為是世界上最有效的防治流感的藥物之一，成為各國(guó)應(yīng)對(duì)可能暴發(fā)的大規(guī)模流感的儲(chǔ)備藥品[8-9]。近十年來(lái)，隨著流感疫情不斷在全球蔓延，莽草酸的供應(yīng)壓力持續(xù)增大。

圖1 莽草酸結(jié)構(gòu)式

目前莽草酸大多從八角提取獲得，其產(chǎn)量受氣候等自然環(huán)境影響較大[10]，再加上提取工藝復(fù)雜、純度難于控制、成本高，莽草酸的產(chǎn)量受到嚴(yán)重限制。

另外，采用微生物發(fā)酵法來(lái)生產(chǎn)莽草酸的研究日益增多[11-14]。但目前公開(kāi)的從發(fā)酵液中提取莽草酸的工藝[15-16]都存在一個(gè)共同的缺點(diǎn)：樹(shù)脂對(duì)莽草酸的吸附量特別低，洗脫液純度低，不同批次間的收率和純度波動(dòng)大等。這導(dǎo)致整個(gè)提取工藝生產(chǎn)效率低、成本高，不適合產(chǎn)業(yè)化。

本研究采用陰離子交換樹(shù)脂預(yù)純化步驟，有效去除了莽草酸預(yù)處理液中絕大部分強(qiáng)結(jié)合力的雜質(zhì)陰離子，進(jìn)而顯著提高了陰離子交換樹(shù)脂精純步驟的處理量、洗脫收率和純度。巧妙利用了預(yù)純化過(guò)程中柱流出液pH和電導(dǎo)率變化與流出液組分變化之間的高度對(duì)應(yīng)關(guān)系，將連續(xù)離子交換技術(shù)運(yùn)用于預(yù)純化，實(shí)現(xiàn)了預(yù)純化過(guò)程的連續(xù)化、自動(dòng)化。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Agilent公司1260高效液相色譜儀，Dionex公司DX-120離子色譜儀，METTLER TOLEDO公司HA405-DPA-SC-S8在線pH電極，METTLER TOLEDO公司2/4電導(dǎo)率傳感器，上海儀電分析儀器有限公司721N可見(jiàn)分光光度計(jì)，臺(tái)州市椒江玻璃儀器廠玻璃層析柱(20 mm X 200 mm)，上海華震科技有限公司HZ201陰離子交換樹(shù)脂。

莽草酸預(yù)處理液由本公司實(shí)驗(yàn)室制得，先由本公司保藏的基因工程菌E.coli HZ09-11發(fā)酵制得莽草酸發(fā)酵液，發(fā)酵液再經(jīng)酸化、陶瓷膜微濾和納濾濃縮得到莽草酸預(yù)處理液。

1.2 分析方法

1.2.1 高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)條件

色譜柱為Grace Smart TM C18(4.6 mm×250 mm，5μm)柱；以0.1% (m/m) H3PO4: 乙腈= 98 : 2 (V:V)為流動(dòng)相；流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，進(jìn)樣濃度為100～800 mg/L,進(jìn)樣量為10 μL。莽草酸含量測(cè)定采用外標(biāo)法，所用對(duì)照品采購(gòu)自sigama公司，含量99.8%。

1.2.2 離子色譜檢測(cè)條件

色譜柱為IonPac?CS12A(4 mm×250 mm)柱，流動(dòng)相為3.5 mmol/L Na2CO3和1 mmol/L NaHCO3的混合液，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為25 μL。

1.3 樹(shù)脂的預(yù)處理

陰離子交換樹(shù)脂采用堿-酸-堿方式再生，最終樹(shù)脂轉(zhuǎn)為OH-型。堿為1 mol/L的NaOH，洗4BV，酸為1 mol/L的HCL，洗4BV，酸洗堿洗之后均采用去離子水洗至pH為6～8。BV是Bed Volume的縮寫(xiě)，指樹(shù)脂柱內(nèi)裝載樹(shù)脂的體積，各種物料量以BV的倍數(shù)來(lái)表示。

1.4 陰離子交換樹(shù)脂單柱預(yù)純化

固定好玻璃層析柱(20 mm×200 mm)，濕法裝填50 mL已再生的HZ201陰離子交換樹(shù)脂。以莽草酸預(yù)處理液為原料，過(guò)飽和上柱，上柱流速為1 BV/h，每0.5～2 BV取柱流出液瞬時(shí)樣進(jìn)行檢測(cè)，包括HPLC、離子色譜、pH、電導(dǎo)率λ、T430 nm。根據(jù)瞬時(shí)樣的各參數(shù)變化趨勢(shì)分析陰離子交換樹(shù)脂單柱預(yù)純化過(guò)程中各組分的分離情況，收集預(yù)純化液。λ高低能夠反映料液中處于解離狀態(tài)的離子濃度高低；預(yù)處理液在波長(zhǎng)430 nm可見(jiàn)光處具有較大吸收，因此，采用T430 nm來(lái)監(jiān)測(cè)預(yù)純化過(guò)程中料液色澤的深淺。

1.5 連續(xù)離子交換系統(tǒng)進(jìn)行陰離子交換樹(shù)脂預(yù)純化

采用的連續(xù)離子交換系統(tǒng)是以三根柱為一個(gè)單元，每根柱尺寸為20 mm×200 mm，每根裝有50 mL的HZ201陰離子交換樹(shù)脂，柱流出液端配備在線pH電極和在線電導(dǎo)率傳感器。系統(tǒng)可根據(jù)柱流出液pH、λ的急劇變化自動(dòng)切換樹(shù)脂柱進(jìn)出口閥門(mén)，在不同的陰離子交換樹(shù)脂柱上分別循環(huán)進(jìn)行上柱、收集、頂洗和再生的不間斷操作，實(shí)現(xiàn)對(duì)預(yù)純化過(guò)程的精準(zhǔn)控制，系統(tǒng)如圖2所示。

圖2 連續(xù)離子交換系統(tǒng)運(yùn)行模式圖

操作過(guò)程如下：（1）以莽草酸預(yù)處理液為原料，從I柱開(kāi)始連續(xù)上柱，當(dāng)I柱流出液的pH開(kāi)始急劇下降時(shí)開(kāi)始收集I柱流出液，至流出液的電導(dǎo)率開(kāi)始急劇上升時(shí)停止收集；（2）隨后，將I柱流出液端串聯(lián)至II柱進(jìn)口端，I柱采用0.5 mol/L乙酸水溶液頂洗2BV，從II柱流出。I柱頂洗結(jié)束后，斷開(kāi)I柱和II柱的連接，I柱開(kāi)始再生，II柱用莽草酸預(yù)處理液開(kāi)始連續(xù)上柱，II柱的上柱、收集、頂洗、再生操作與I柱相同，系統(tǒng)按照I-II-III-I的順序循環(huán)進(jìn)行陰離子交換樹(shù)脂柱預(yù)純化；（3）收集的柱流出液即為陰離子交換樹(shù)脂預(yù)純化液。再生程序即“水-堿-水”方式再生，先水洗至pH＞5，再采用1 mol/L NaOH淋洗4BV，最后水洗至pH＜8待用。

1.6 陰離子交換樹(shù)脂精純

以陰離子交換樹(shù)脂預(yù)純化液為原料，上柱至裝有50 mL已再生的HZ201陰離子交換樹(shù)脂的分離柱，樹(shù)脂吸附飽和后水洗2BV，再用1 mol/L乙酸水溶液洗脫5BV，洗脫過(guò)程中采用HPLC檢測(cè)洗脫液中莽草酸的色譜純度，收集色譜純度≥98%的部分。

2 結(jié)果與討論

2.1 莽草酸預(yù)處理液成分分析

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)莽草酸預(yù)處理液中含有大量結(jié)合力強(qiáng)于莽草酸根的雜質(zhì)陰離子，這些雜質(zhì)陰離子占據(jù)了陰離子交換樹(shù)脂大部分的交換基團(tuán)，導(dǎo)致了陰離子交換樹(shù)脂對(duì)莽草酸的有效吸附量非常低，并且也降低了莽草酸與結(jié)構(gòu)類似雜質(zhì)在陰離子交換樹(shù)脂上的分離度，導(dǎo)致洗脫液交叉嚴(yán)重。

采用1.4的方法過(guò)飽和上柱，柱流出液經(jīng)離子色譜、HPLC檢測(cè)，結(jié)果如表1所示，柱流出液顏色明顯淺于上柱原料。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)預(yù)處理液中強(qiáng)結(jié)合力的雜質(zhì)陰離子及其與陰離子交換樹(shù)脂結(jié)合力強(qiáng)弱順序如下：強(qiáng)解離的負(fù)電色素＞SO42-＞PO43-＞Cl-＞3-脫氫莽草酸根(DHS-)＞莽草酸根(SA-)。其中強(qiáng)解離的負(fù)電色素、SO42-、PO43-結(jié)合力最強(qiáng)，可看作A組分；Cl-略強(qiáng)于DHS-，DHS-略強(qiáng)于SA-，可將Cl-、DHS-看作B組分。

因此去除莽草酸預(yù)處理液中A、B組分成為提高陰離子交換樹(shù)脂處理量和純化效果的關(guān)鍵。

2.2 陰離子交換樹(shù)脂單柱預(yù)純化

采用1.4的方法過(guò)飽和上柱，可以利用預(yù)處理液中結(jié)合力強(qiáng)的組分置換出結(jié)合力弱的組分。預(yù)純化去除了預(yù)處理液中部分結(jié)合力比莽草酸根弱的雜質(zhì)以及絕大部分結(jié)合力比莽草酸根強(qiáng)的A、B組分。以預(yù)處理液為原料進(jìn)行陰離子交換樹(shù)脂單柱預(yù)純化，原料中莽草酸濃度為7000 μg/mL，色譜純度88%。所得預(yù)純化液中莽草酸濃度C、pH和電導(dǎo)率λ隨上柱液體積V的增加而變化的趨勢(shì)如圖3所示。

圖中有兩個(gè)明顯的拐點(diǎn)，14 BV時(shí)流出液pH和T430 nm開(kāi)始急劇下降、λ值有小幅躍升，莽草酸濃度C開(kāi)始急劇上升至原料濃度以上，說(shuō)明此時(shí)柱內(nèi)樹(shù)脂上的OH-已經(jīng)被置換完全，幾乎沒(méi)有OH-流出，上柱原料中的A、B組分開(kāi)始將柱內(nèi)的SA-置換出來(lái)；至86BV時(shí)，流出液λ值開(kāi)始急劇上升，pH逐漸下降，C開(kāi)始逐漸下降，B組分開(kāi)始略微穿透，說(shuō)明此時(shí)柱內(nèi)的莽草酸接近被置換完全，結(jié)合力比莽草酸略強(qiáng)的B組分(Cl-、DHS-)開(kāi)始被置換出來(lái)，Cl-被置換出來(lái)后生成強(qiáng)解離的HCL，所以流出液pH下降、λ急劇上升。A組分仍結(jié)合在樹(shù)脂柱上。收集這兩個(gè)拐點(diǎn)之間的料液作為陰離子交換樹(shù)脂預(yù)純化液。

收集的預(yù)純化液幾乎不含A組分，僅存在極少量的B組分(Cl-、DHS-)，色譜純度達(dá)到97.4%。預(yù)純化液中莽草酸濃度為10500 μg/mL，提高到了上柱原料濃度的1.5倍，料液顏色明顯下降，電導(dǎo)率降低至上柱原料的1/3以下。HZ201陰離子交換樹(shù)脂預(yù)純化處理量達(dá)到1L樹(shù)脂可處理莽草酸602g。

柱流出液pH、λ曲線的拐點(diǎn)與柱流出液組分變化高度對(duì)應(yīng)，拐點(diǎn)變化趨勢(shì)明顯，因此，可以根據(jù)在線pH、λ的變化對(duì)預(yù)純化過(guò)程實(shí)行精準(zhǔn)控制。

2.3 利用連續(xù)離子交換技術(shù)進(jìn)行陰離子交換樹(shù)脂預(yù)純化

采用單根陰離子交換樹(shù)脂柱進(jìn)行預(yù)純化，在停止收集后，還有少量的莽草酸結(jié)合在樹(shù)脂上，并與B組分交叉在一起。為了提高預(yù)純化收率、并使預(yù)純化樹(shù)脂處理量達(dá)到最大化，更為了實(shí)現(xiàn)陰離子交換樹(shù)脂預(yù)純化過(guò)程的連續(xù)化和自動(dòng)化，按照1.5的方法，采用連續(xù)離子交換系統(tǒng)進(jìn)行陰離子交換樹(shù)脂預(yù)純化。

表1 HZ201陰離子交換樹(shù)脂過(guò)飽和上柱流出液中主要陰離子濃度

圖3 HZ201陰離子交換樹(shù)脂預(yù)純化各參數(shù)變化曲線

連續(xù)離子交換系統(tǒng)總樹(shù)脂體積150 mL，上柱原料體積50L，原料中莽草酸濃度7000 μg/mL。收集得到預(yù)純化液27.1L，莽草酸濃度12500 μg/mL，色譜純度96.7%，莽草酸總質(zhì)量338.8 g，預(yù)純化收率96.8%。

整個(gè)預(yù)純化過(guò)程完全實(shí)現(xiàn)了連續(xù)化、自動(dòng)化，可以連續(xù)不斷地上柱并收集陰離子交換樹(shù)脂預(yù)純化液。系統(tǒng)可根據(jù)柱流出液pH、λ的變化對(duì)預(yù)純化過(guò)程實(shí)行精準(zhǔn)自動(dòng)控制，不需要進(jìn)行HPLC、離子色譜檢測(cè)，就能保證所得預(yù)純化液的質(zhì)量穩(wěn)定均一。預(yù)純化過(guò)程不需要使用洗脫劑，頂洗液用量少，因此產(chǎn)生的廢水量也很少。

2.4 陰離子交換樹(shù)脂精純

陰離子交換樹(shù)脂預(yù)純化液色譜純度＞96%，色澤淺，但是料液中還含有較多的糖及其它非色譜雜質(zhì)，需要進(jìn)一步精純。采用1.6的方法對(duì)預(yù)純化液進(jìn)一步精純，當(dāng)HZ201樹(shù)脂接近吸附飽和時(shí)，吸附量達(dá)到1L樹(shù)脂吸附莽草酸100 g，與未經(jīng)過(guò)預(yù)純化相比，經(jīng)過(guò)預(yù)純化后，精純步驟樹(shù)脂處理量可達(dá)到原來(lái)的10倍以上。精純洗脫液色譜純度達(dá)99.4%以上，含量99%以上，3-脫氫莽草酸色譜純度0.5%以下，洗脫收率95%以上。洗脫液的HPLC圖譜如圖4所示。

由于精純洗脫液純度高、色澤淺，不需要進(jìn)行脫色、結(jié)晶等操作，直接濃縮、噴霧干燥可得到高純度莽草酸成品。成品的色譜純度和含量都達(dá)到99%以上，提取總收率達(dá)到80%以上。

3 結(jié)論

圖4 預(yù)處理液及精純洗脫液HPLC圖譜

本文開(kāi)發(fā)的連續(xù)離子交換技術(shù)高效純化莽草酸的工藝，解決了發(fā)酵法生產(chǎn)莽草酸的提取工藝瓶頸，所得成品純度高、質(zhì)量穩(wěn)定均一，提取收率高；該工藝綠色環(huán)保，樹(shù)脂總使用量減少了約80%，總廢水產(chǎn)生量也隨之大幅減少；同時(shí)該工藝實(shí)現(xiàn)了生產(chǎn)的高度自動(dòng)化和連續(xù)化，響應(yīng)了ICH Q13對(duì)連續(xù)化生產(chǎn)的大力倡導(dǎo)。采用該工藝能大幅降低發(fā)酵法制備莽草酸的生產(chǎn)成本，極具市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，具有產(chǎn)業(yè)化可行性。