姚永青，郜繼東，劉英

(河南省食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州 450018)

抗生素微生物檢定法是國際上通用的、經(jīng)典的抗生素效價測定方法，在各國藥典中被普遍采用，系利用抗生素在低濃度抑制或殺死微生物的特點(diǎn)，以其抗菌活性為指標(biāo)，衡量其活性成分效力的方法。雖伴隨HPLC等化學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，一些抗生素品種的效價測定已被化學(xué)分析法替代，但由于該方法可以直觀、特異的反映抗生素藥品的抗菌活性，具有與臨床的一致性；多組分抗生素由于不同活性組分生物活性的差異，化學(xué)測定結(jié)果難以準(zhǔn)確表征組分組成、含量與生物活性間的關(guān)系；某些抗生素目前尚無適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)分析方法表征其活性，因此抗生素微生物檢定法在各國藥典中仍占有重要的地位[1]。

中國藥典2015年版(ChP2015)四部通則收載的抗生素微生物檢定法包括管碟法與比濁法，管碟法是抗生素效價測定的經(jīng)典方法，系利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基的平面擴(kuò)散作用，采用量-反應(yīng)平行線原理和交叉實(shí)驗(yàn)設(shè)計方法，在相同條件下通過比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品兩者對試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測定供試品效價的方法[2]。管碟法試驗(yàn)過程中影響因素較多，如試驗(yàn)菌活性不佳、菌齡過老、市售培養(yǎng)基(包括傳代培養(yǎng)基和檢定培養(yǎng)基)質(zhì)量參差不齊等。因此選擇合適的菌種和培養(yǎng)基是抗生素微生物效價測定試驗(yàn)的必要條件。

本文以卷曲霉素為例，考察菌種、菌種傳代培養(yǎng)基及抗生素檢定培養(yǎng)基對抗生素微生物檢定法的影響，確定抗生素微生物檢定法的系統(tǒng)適用性條件。卷曲霉素是美國禮來公司E.B.Htrr等于1950年從卷曲鏈霉素的培養(yǎng)基中分離得到的多肽類抗結(jié)核抗生素[3]。70年代初，中國科學(xué)院北京微生物研究所引進(jìn)了卷曲鏈霉菌種，1975年由四川抗生素工業(yè)研究所和四川長征制藥廠聯(lián)合研制，1986年由豫南制藥廠大批量生產(chǎn)。我國目前劑型為注射用硫酸卷曲霉素，臨床主要用于復(fù)治、難治及耐藥性肺結(jié)核[4]，其不良反應(yīng)主要有聽覺減弱、腎功能損害、電解質(zhì)紊亂、皮膚過敏等。Chp2015版二部、美國藥典40版(USP40)、英國藥典2000版(BP2000)與國際藥典(Ph.Int)第5版均收載原料藥與注射劑。

硫酸卷曲霉素法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為Chp2015二部[5]，含量標(biāo)定為管碟法-三劑量法，試驗(yàn)菌為枯草芽孢桿菌CMCC(B)63 501，菌種傳代培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，抗生素濃度范圍為10.0～40.0 U/mL，抗生素檢定培養(yǎng)基為I號培養(yǎng)基pH7.8～8.0。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示中間濃度卷曲霉素溶液(20 U/mL)所致抑菌圈直徑相同時，同企業(yè)不同批號的檢定培養(yǎng)基所需菌懸液濃度明顯不同；采用相同的檢定培養(yǎng)基時，不同的菌懸液濃度相差較大；采用相同的菌懸液和不同的檢定培養(yǎng)基時，中間濃度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直徑相差較大，見表1。

由表1可知，不同品牌培養(yǎng)基傳代的菌種和不同品牌抗生素檢定培養(yǎng)基對中間濃度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直徑均有一定影響，文獻(xiàn)[6]指出試驗(yàn)菌與培養(yǎng)基的質(zhì)量對抑菌圈邊緣的清晰度均有影響，因此選用中檢院標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC(B)63501和美國菌種保藏中心標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6633，分別用兩種品牌培養(yǎng)基進(jìn)行傳代備用，選擇卷曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品配制抗生素微生物效價測定溶液，再分別采用五種品牌檢定培養(yǎng)基進(jìn)行抗生素微生物檢定管碟法試驗(yàn)，考察不同來源標(biāo)準(zhǔn)菌株、不同品牌傳代培養(yǎng)基與不同品牌檢定培養(yǎng)基對管碟法效價測定的影響，為抗生素微生物檢定法試驗(yàn)條件的選擇與培養(yǎng)基的質(zhì)量控制提供參考，同時確定管碟法的系統(tǒng)適用性條件。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑

SQ810C立式壓力蒸汽滅菌器(重慶雅馬拓科技有限公司)，BD240孵卵箱(德國BINDER公司)，ZY-300IV多功能微生物自動測量儀(北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司)，XPE205電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)，T100? Thermal Cycler PCR 儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)。

表1 卷曲霉素效價標(biāo)定預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀均為分析純，水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

選擇兩種不同來源的枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行試驗(yàn)，見表2。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 菌種復(fù)蘇用培養(yǎng)基

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號3106239，C企業(yè))。

1.3.2 菌種傳代用培養(yǎng)基

兩種培養(yǎng)基成分與pH值均有差異，見表3。

1.3.3 抗生素檢定培養(yǎng)基

選擇國內(nèi)5種抗生素檢定培養(yǎng)基I號進(jìn)行試驗(yàn)，見表4。

1.4 樣品

卷曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號130339-201403，878U/mg，中國食品藥品檢定研究院)。

2 方法

2.1 抗生素微生物檢定法

見Chp2015四部通則1201抗生素微生物檢定法-管碟法。

2.2 溶液的制備

精密稱取卷曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加水溶解并制成每1 mL中約含1000單位的溶液，加pH7.8磷酸鹽緩沖液制成每1 mL中約含16單位、20單位與25單位的溶液，作為供試品溶液。

表2 試驗(yàn)用菌種信息

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇及菌種鑒定

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的開啟及培養(yǎng)

于超凈工作臺上分別開啟標(biāo)準(zhǔn)菌株I、II，用“1.3.1”培養(yǎng)基復(fù)蘇，37℃培養(yǎng)22h后分別接種于“1.3.2”培養(yǎng)基a、b的斜面與培養(yǎng)皿上，于37℃培養(yǎng)22h，得斜面與培養(yǎng)皿培養(yǎng)物。分別取培養(yǎng)基a、b的斜面培養(yǎng)物分別接種于培養(yǎng)基a、b茄氏瓶上，于37℃培養(yǎng)7d。

3.1.2 菌種的形態(tài)鑒定

標(biāo)準(zhǔn)菌株I、II在“1.3.1”液體培養(yǎng)基表面均有一層菌膜，菌生長狀態(tài)均良好。

標(biāo)準(zhǔn)菌株I在“1.3.2”培養(yǎng)基a、b斜面、茄氏瓶與培養(yǎng)皿上培養(yǎng)物的形態(tài)相同，均為菌落干枯發(fā)白，接種棒難以挑取菌落，菌落附著感很強(qiáng)；標(biāo)準(zhǔn)菌株II在“1.3.2”培養(yǎng)基a、b斜面、茄氏瓶與培養(yǎng)皿上培養(yǎng)物的形態(tài)相同，均為菌落白色較光滑，接種棒易于挑取菌落，菌落無附著感。

結(jié)果顯示不同來源標(biāo)準(zhǔn)菌株在相同品牌傳代培養(yǎng)基上目視菌落形態(tài)差異較大，相同來源標(biāo)準(zhǔn)菌株在不同品牌傳代培養(yǎng)基上目視菌落形態(tài)一致，表明標(biāo)準(zhǔn)菌株來源影響菌落形態(tài)，傳代培養(yǎng)基品牌不影響菌落形態(tài)。

3.1.3 菌種的儀器鑒定

分別對標(biāo)準(zhǔn)菌株I、II在“1.3.2”項下 a、b培養(yǎng)基培養(yǎng)物進(jìn)行16s rDNA序列分析，鑒定為枯草芽孢桿菌，鑒定率99%以上，結(jié)果表明不同來源標(biāo)準(zhǔn)菌株I、II均為枯草芽孢桿菌。

3.1.4 小結(jié)

綜上所述，標(biāo)準(zhǔn)菌株I、II均為枯草芽孢桿菌，但其菌落形態(tài)不同，傳代培養(yǎng)基品牌不影響菌落形態(tài)。

表3 菌種傳代用培養(yǎng)基

表4 抗生素檢定培養(yǎng)基I號(pH7.8～8.0)

3.2 菌懸液制備

取標(biāo)準(zhǔn)菌株I、II的“1.3.2”培養(yǎng)基a、b茄氏瓶培養(yǎng)物各4瓶，分別用滅菌水40mL洗下，制得4種試驗(yàn)用菌懸液，見表5。

3.3 試驗(yàn)結(jié)果

分別采用“3.2”項下4種菌懸液和“1.3.3”項下5種檢定培養(yǎng)基進(jìn)行卷曲霉素抗生素微生物效價管碟法試驗(yàn)，所用菌懸液濃度均為0.5%。

3.3.1 采用i號菌懸液和5種不同品牌檢定培養(yǎng)基的試驗(yàn)結(jié)果

采用i號菌懸液和“1.3.3”項下5種不同品牌檢定培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，雙碟菌層形態(tài)和20 U/mL卷曲霉素溶液所致抑菌圈直徑結(jié)果見表6。

由表6可知，i號菌懸液在各企業(yè)檢定培養(yǎng)基上菌層均濃密。采用B、C與F企業(yè)檢定培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈均圓整清晰，易于測量；采用D企業(yè)檢定培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈邊緣可見單個菌落，采用E企業(yè)檢定培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈有輕微雙圈現(xiàn)象，均可通過調(diào)整抑菌圈測量儀參數(shù)進(jìn)行測量。20 U/mL卷曲霉素溶液在五種檢定培養(yǎng)基中所致抑菌圈直徑15.4mm～20.8mm，表明菌液濃度相同時，卷曲霉素溶液在各品牌檢定培養(yǎng)基上抑菌效力為B企業(yè)＞F企業(yè)＞E企業(yè)＞D企業(yè)＞C企業(yè)。

3.3.2 采用ii號菌懸液和5種不同品牌檢定培養(yǎng)基的試驗(yàn)結(jié)果

采用ii號菌懸液和“1.3.3”項下5種不同品牌檢定培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，雙碟菌層形態(tài)和20 U/mL卷曲霉素溶液所致抑菌圈直徑結(jié)果見表7。

由表7可知，ii號菌懸液在各企業(yè)檢定培養(yǎng)基上菌層均有顆粒感，菌層濃密情況不同。采用C企業(yè)檢定培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈清晰圓整，易于測量；采用D與E企業(yè)檢定培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈邊緣可見單個菌落，可通過調(diào)整抑菌圈測量儀參數(shù)進(jìn)行測量；因?yàn)榫鷮酉”∏矣蓄w粒感，所以采用B與F企業(yè)檢定培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈邊緣對測量有影響。20 U/mL卷曲霉素溶液在五種檢定培養(yǎng)基中所致抑菌圈直徑17.1mm～24.2mm，表明菌液濃度相同時，卷曲霉素溶液在各品牌檢定培養(yǎng)基上抑菌效力為B企業(yè)＞E企業(yè)＞F企業(yè)＞D企業(yè)＞C企業(yè)。

表5 試驗(yàn)用菌懸液

3.3.3 采用iii號菌懸液和5種不同品牌檢定培養(yǎng)基的試驗(yàn)結(jié)果

采用iii號菌懸液和“1.3.3”項下5種不同品牌檢定培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，雙碟菌層形態(tài)和20 U/mL卷曲霉素溶液所致抑菌圈直徑結(jié)果見表8。

由表8可知，iii號菌懸液在B、C、D與E企業(yè)檢定培養(yǎng)基上菌層均濃密，在F企業(yè)檢定培養(yǎng)基上菌層較濃密。采用B、C企業(yè)檢定培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈邊緣均圓整清晰，易于測量；采用D企業(yè)檢定培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈邊緣可見單個菌落，采用E企業(yè)檢定培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈有輕微雙圈現(xiàn)象，采用F企業(yè)檢定培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈較圓整，均可通過調(diào)整抑菌圈測量儀參數(shù)進(jìn)行測量。20 U/mL卷曲霉素溶液在五種檢定培養(yǎng)基中所致抑菌圈直徑16.0mm～22.1mm，表明菌液濃度相同時，卷曲霉素溶液在各品牌檢定培養(yǎng)基上抑菌效力為B企業(yè)＞F企業(yè)＞E企業(yè)＞D企業(yè)＞C企業(yè)。

3.3.4 采用iv號菌懸液和5種不同品牌檢定培養(yǎng)基的試驗(yàn)結(jié)果

采用iv號菌懸液和“1.3.3”項下5種不同品牌檢定培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，雙碟菌層形態(tài)和20 U/mL卷曲霉素溶液所致抑菌圈直徑結(jié)果見表9。

由表9可知，iv號菌懸液在B、C、D與E企業(yè)檢定培養(yǎng)基上菌層濃密；在F企業(yè)檢定培養(yǎng)基上菌層稀薄，有顆粒感。采用C企業(yè)檢定培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈清晰圓整，易于測量；采用B企業(yè)檢定培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈邊緣可見單個菌落，采用D與F企業(yè)檢定培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈較圓整清晰，采用E企業(yè)檢定培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈有輕微雙圈現(xiàn)象且邊緣可見單個菌落，均可通過調(diào)整抑菌圈測量儀參數(shù)進(jìn)行測量。20 U/mL卷曲霉素溶液在上述五種檢定培養(yǎng)基中所致抑菌圈直徑16.4mm～23.8mm，表明菌液濃度相同時，卷曲霉素溶液在各品牌檢定培養(yǎng)基上抑菌效力為B企業(yè)＞F企業(yè)＞E企業(yè)＞C企業(yè)＞D企業(yè)。

表6 i號菌懸液和5種不同品牌檢定培養(yǎng)基的試驗(yàn)結(jié)果

3.3.5 對檢定培養(yǎng)基的綜合評分

對四種菌懸液和5種不同品牌檢定培養(yǎng)基的試驗(yàn)結(jié)果按照菌株生長狀態(tài)、菌層致密程度、中間濃度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直徑大小與抑菌圈邊緣清晰程度進(jìn)行綜合評分，見表10。結(jié)果表明B企業(yè)的檢定培養(yǎng)基質(zhì)量較差，C企業(yè)的檢定培養(yǎng)基質(zhì)量較好。

4 討論

4.1 卷曲霉素效價測定

4.1.1 試驗(yàn)菌

取不同來源標(biāo)準(zhǔn)菌株用同品牌培養(yǎng)基傳代制備菌懸液，采用相同品牌的檢定培養(yǎng)基進(jìn)行效價測定時，結(jié)果采用I號標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行的試驗(yàn)，中間濃度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直徑較小，菌層較致密，抑菌圈較清晰，表明采用I號標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌層生長較好。

4.1.2 菌種傳代培養(yǎng)基

取相同來源標(biāo)準(zhǔn)菌株，分別采用A與B企業(yè)培養(yǎng)基傳代后制備菌懸液，采用相同品牌的檢定培養(yǎng)基進(jìn)行效價測定，結(jié)果采用A企業(yè)傳代培養(yǎng)基的菌層比后者濃密，中間濃度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直徑前者小于后者，采用前者的雙碟菌層生長狀況比后者優(yōu)良。分析兩企業(yè)培養(yǎng)基成分，A企業(yè)培養(yǎng)基含酵母浸出物，能提供細(xì)菌在生命活動過程中需要的生長因子[7]，其他成分基本一致，但其原料中蛋白胨、瓊脂與肉浸液的來源和批號不同，導(dǎo)致其內(nèi)在質(zhì)量存在差異，因此上述兩種培養(yǎng)基所提供營養(yǎng)物質(zhì)的差異導(dǎo)致菌落性狀產(chǎn)生差異，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上細(xì)菌分裂繁殖速率較快，產(chǎn)生的抑菌圈相對較小，反之，產(chǎn)生的抑菌圈較大。建議根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇能提供所需營養(yǎng)物質(zhì)的最適傳代培養(yǎng)基。

4.1.3 檢定培養(yǎng)基

取相同來源標(biāo)準(zhǔn)菌株，采用相同品牌培養(yǎng)基傳代并制備菌懸液，采用不同品牌的檢定培養(yǎng)基進(jìn)行效價測定，結(jié)果采用B企業(yè)檢定培養(yǎng)基的中間濃度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直徑為20.8mm～24.2mm，不符合三劑量法對抑菌圈直徑(15mm～18mm)的要求；采用C、D與E企業(yè)檢定培養(yǎng)基的試驗(yàn)，中間濃度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直徑均在15mm～18mm；采用i、ii、iii號菌懸液和F企業(yè)檢定培養(yǎng)基的中間濃度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直徑在15mm～18mm，采用iv號菌懸液和F企業(yè)檢定培養(yǎng)基的中間濃度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直徑為19.7mm。表明B企業(yè)培養(yǎng)基上菌層生長狀態(tài)相對較差，因此中間濃度卷曲霉素溶液所致抑菌圈直徑相對較大。

表7 ii號菌懸液和5種不同品牌檢定培養(yǎng)基的試驗(yàn)結(jié)果

表8 iii號菌懸液和5種不同品牌檢定培養(yǎng)基的試驗(yàn)結(jié)果

表9 iv號菌懸液和5種不同品牌檢定培養(yǎng)基的試驗(yàn)結(jié)果

表10 4種菌懸液和5種不同品牌檢定培養(yǎng)基的試驗(yàn)綜合評分

對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評分，結(jié)果B企業(yè)的檢定培養(yǎng)基質(zhì)量較差，C企業(yè)的檢定培養(yǎng)基質(zhì)量較好。文中5種檢定培養(yǎng)基成分基本一致，但其原料中胨、牛肉浸出粉與瓊脂的來源和批號不同，導(dǎo)致其內(nèi)在質(zhì)量存在差異，因此需進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)以選擇最適檢定培養(yǎng)基，并建議對培養(yǎng)基的質(zhì)量進(jìn)行控制。

4.1.4 小結(jié)

采用相同品牌傳代培養(yǎng)基和相同品牌檢定培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，I號標(biāo)準(zhǔn)菌株生長相對較好；采用相同來源標(biāo)準(zhǔn)菌株和同品牌檢定培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，A企業(yè)的傳代培養(yǎng)基制備的菌懸液菌層生長較好；采用相同來源標(biāo)準(zhǔn)菌株和同品牌傳代培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，B企業(yè)的檢定培養(yǎng)基所致抑菌圈較大，不符合三劑量法抑菌圈直徑在15mm～18mm的要求。

4.2 效價測定的系統(tǒng)適用性

抗生素微生物檢定法通常需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定最佳的試驗(yàn)條件，如試驗(yàn)菌傳代培養(yǎng)基的選擇、試驗(yàn)菌的濃度與加菌量、抗生素溶液的濃度、抗生素檢定培養(yǎng)基的選擇等，使抑菌圈圓整清晰，便于測量，抑菌圈直徑大小符合規(guī)定，即二劑量法高濃度抗生素溶液所致抑菌圈直徑在18～22mm，三劑量法中間濃度抗生素溶液所致抑菌圈直徑在15～18mm。該試驗(yàn)說明標(biāo)準(zhǔn)菌株、菌種傳代用培養(yǎng)基與檢定培養(yǎng)基的來源均對效價測定有影響，而菌種在ChP2015通則中有明確規(guī)定，因此抗生素微生物效價測定時應(yīng)選擇最適傳代培養(yǎng)基與檢定培養(yǎng)基作為效價測定的系統(tǒng)適用性條件；目前國內(nèi)培養(yǎng)基質(zhì)量參差不齊，應(yīng)對培養(yǎng)基質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格控制。