侯麗麗，劉春龍，王 成，米彥飛，馬晉東，劉 星

(1.山西省飼料獸藥監(jiān)察所，太原 030027；2.山西鑫華澤藥業(yè)有限公司，晉中 030900)

七清敗毒顆粒收載于《中國獸藥典》2015版二部，具有清熱解毒，燥濕止瀉功能，主治濕熱泄瀉，雛雞白痢[1]，處方中黃芩為君藥。黃芩為唇形科植物黃芩 (ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥的根，屬于傳統(tǒng)中藥[2-3]。春、秋二季采挖，除去須根和泥沙，曬后撞去粗皮，曬干。黃芩苷為黃酮類化合物，無臭，味苦，是中藥黃芩的主要有效成分[4-6]。七清敗毒顆粒標(biāo)準(zhǔn)中無黃芩苷的含量測定項，為了更好控制產(chǎn)品質(zhì)量，試驗對七清敗毒顆粒中黃芩苷的含量測定方法進(jìn)行了研究。

1 儀器與材料

Agilent1200高效液相色譜系統(tǒng)，原裝色譜工作站，四元梯度泵/G1311A，自動進(jìn)樣器/G1329A，柱溫箱/G1316A，紫外檢測器/G1314B，購于安捷倫科技有限公司。甲醇為色譜級，磷酸為優(yōu)級，水為超純水。黃芩苷對照品(批號Z0271705，含量96.8%)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。七清敗毒顆粒(批號20180415)100g/袋，山西雙鷹動物藥業(yè)有限公司提供。3家自制樣，12家市售樣共15個批次樣品。不加黃芩的陰性樣(批號20180415)100g/袋，山西雙鷹動物藥業(yè)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜條件 根據(jù)參考文獻(xiàn)方法[1,7-11]和實驗結(jié)果，采用色譜柱Thermo scientific BDS C18(4.6 mm×250 mm，5μm)，流動相為甲醇-水-磷酸(41∶59∶0.2)，檢測波長為280 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗 取供試品溶液10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明：黃芩苷與相鄰峰達(dá)到基線分離，分離度達(dá)到1.75，黃芩苷峰保留時間為16.0 min，理論板數(shù)為7923，峰面積為1399.80，峰高為51.24。試驗證實，該方法系統(tǒng)適用性良好，見圖1。

圖1 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗圖Fig 1 Experimental diagram of system adaptability

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對照品30 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得600 μg/mL的黃芩苷對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液，加甲醇稀釋成30 μg/mL黃芩苷對照品溶液，即得。

2.4 供試品溶液的制備 取本品研細(xì)的粉末1.0 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 陰性樣品溶液的制備 用不含黃芩的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備得到陰性樣品溶液。

2.6 專屬性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測定，供試品色譜中在與對照品色譜峰相應(yīng)的位置出相同峰，陰性樣品無吸收峰、無干擾，說明處方中其它成分不影響黃芩苷的含量測定，結(jié)果見圖2～圖4。

圖2 黃芩苷對照品HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of baicalin reference

圖3 七清敗毒顆粒樣品HPLC色譜圖Fig 3 HPLC chromatogram of qiqing xiedu granules

圖4 黃芩陰性樣品HPLC色譜圖Fig 4 HPLC chromatogram of scutellaria negative sample

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 線性關(guān)系試驗 取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含黃芩苷600 μg的溶液，即得對照品儲備液。分別取儲備液適量制成5、15、30、45、60、120 μg/mL黃芩苷對照品溶液，濾過，取續(xù)濾液，分別按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL，測定峰面積。結(jié)果見表1。

表1 線性試驗數(shù)據(jù)表Tab 1 Linear test data sheet

以峰面積為縱坐標(biāo)，黃芩苷含量(X-mg/mL)為橫坐標(biāo)作線性回歸，回歸方程為：y=33.822 x + 28.9555，r = 0.9991，結(jié)果表明，黃芩苷在0.005～0.12 mg/mL(0.05～0.12 μg)范圍內(nèi)，峰面積與黃芩苷含量呈良好的線性關(guān)系。

圖5 黃芩苷線性關(guān)系圖Fig 5 Linear diagram of baicalin

2.7.2 精密度試驗 取線性試驗項下的同一份對照品(30 μg/mL)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，精密度試驗相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.92%，結(jié)果表明儀器有良好的精密度。結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗數(shù)據(jù)表Tab 2 Precision test data sheet

2.7.3 重復(fù)性試驗 對同一批供試品樣品QK-002(批號20180415)，配制6份供試品溶液，各取10 μL注入色譜儀，6份樣品相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為 0.93%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗數(shù)據(jù)表Tab 3 Repeatability test data sheet

2.7.4 溶液穩(wěn)定性試驗 取同一供試品QK-002(批號20180415)溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖和黃芩苷峰面積，供試品12 h內(nèi)峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.82%，結(jié)果表明，樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

試驗結(jié)果見表4。

表4 溶液穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)表Tab 4 Solution stability test data sheet

2.7.5 加樣回收率試驗 對照品溶液制備：取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含黃芩苷600 μg的溶液，即得對照品溶液。

加樣回收樣品溶液制備：精密稱取同一批七清敗毒顆粒陰性樣品(批號20180415)1 g，置100 mL量瓶，分別加入上述對照品溶液2.5、2.5、5、5、7.5、7.5 mL，加甲醇適量，超聲30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

照上述供試品方法制備6份供試品溶液，取10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，計算加樣回收率。

回收率=(加對照品后測得的含量-加對照品前的含量)/實際所加對照品量×100%。結(jié)果見表5～表7。

表5 加樣回收率試驗結(jié)果1Tab 5 Recovery test results 1

表6 加樣回收率試驗結(jié)果2Tab 6 Recovery test results 2

表7 加樣回收率試驗結(jié)果3Tab 7 Recovery test results 3

結(jié)果表明，3次試驗相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為1.51%、0.74%、0.89%，回收率試驗符合規(guī)定。

2.8 耐用性試驗

2.8.1 改變流動相中磷酸比例 取同一批供試品，改變流動相溶液比例(甲醇-水-磷酸的比例分別為43∶57∶0.18、43∶57∶0.22)進(jìn)行測定，結(jié)果見表8。

表8 不同流動相比例試驗數(shù)據(jù)表Tab 8 Test data sheet of different mobile phase ratios

結(jié)果同一供試品改變流動相比例后，RSD為0.36%。

2.8.2 改變供試品超聲時間 改變超聲時間(10 min，50 min)進(jìn)行測定，結(jié)果見表9。

表9 不同超聲時間試驗數(shù)據(jù)表Tab 9 Test data sheets of different ultrasonic time

同一供試品在改變超聲時間的條件下，RSD為0.22%。

2.8.3 改變柱溫 改變柱溫(28℃、32℃)進(jìn)行測定，結(jié)果見表10。

同一供試品在改變柱溫的條件下，RSD為0.57%。

2.9.4 不同色譜柱 分別用Thermo scientific BDS HYPERSIL C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，Syncroni AQC18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，Agilent XDB C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)三種不同的色譜柱進(jìn)行測定，結(jié)果見表11。

表10 不同柱溫試驗數(shù)據(jù)表Tab 10 Test data table of different column temperatures

表11 不同規(guī)格色譜柱試驗數(shù)據(jù)表Tab 11 Table of chromatographic column test data of different specifications

同一供試品在更換不同色譜柱下進(jìn)行測定，RSD為0.80%。結(jié)果表明該方法耐用性良好。

2.9 樣品測定 按以上確定的高效液相色譜法測定了15批七清敗毒顆粒中黃芩苷含量的方法，結(jié)果見表12。

表12 15批樣品含量測定結(jié)果Tab 12 Content determination results of 15 batches of samples

3 討論與結(jié)論

目前，用高效液相色譜法測定黃芩苷含量的制劑很多，所用的流動相有甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)280 nm黃芩藥材[1]、(43∶57∶0.2)278 nm四黃止痢顆粒[2]、(50∶50∶0.3)276 nm，甲醇-水-冰醋酸(50∶50∶1)274 nm/276 nm雙黃連可溶性粉/雙黃連注射液[3]等。用《中國獸藥典》中黃芩藥材流動相為甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)[1]，檢測波長280 nm，Agilent 150 mm色譜柱，6 min出峰；Agilent 250 mm色譜柱，流動相甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)，11 min出峰，理論塔板數(shù)2500；Thermo scientific BDS C18 250 mm，流動相甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)，9 min出峰，有前沿峰、拖尾，調(diào)整流動相為甲醇-水-磷酸(45∶55∶0.2)11 min出峰，理論板數(shù)7000，但發(fā)現(xiàn)對照主峰前有小峰，與主峰的分離度僅為1.32，再調(diào)整流動相為甲醇-水-磷酸(41∶59∶0.2)，用Thermo scientific BDS C18 250 mm試驗，主峰約15.797 min出峰，用分離度切線法統(tǒng)計，理論塔板數(shù)達(dá)7837，分離度1.66，峰寬0.4174，對稱因子1.09，峰高79.65，峰起始點(diǎn)14.957，結(jié)束點(diǎn)16.938，保留時間15.797符合要求，設(shè)置進(jìn)樣時間45 min/針。再換Agilent 250 mm色譜柱，流動相為甲醇-水-磷酸(41∶59∶0.2)出峰時間21 min，右邊有一小峰，理論板數(shù)7000，分離度差別不明顯?？紤]樣品雜峰較多，最終確定用Thermo scientific BDS C18 250 mm色譜柱，流動相為甲醇-水-磷酸(41∶59∶0.2)達(dá)到良好分離效果。

供試品溶液制備時比較了回流提取法與超聲提取法的效果，結(jié)果二者無明顯差異，超聲提取法較為簡單，故選用超聲提取法。按超聲提取法分別超聲時間15、30、45 min，測定黃芩苷含量，結(jié)果表明15 min結(jié)果偏低，超聲30 min與45 min無明顯差異，故超聲時間定為30 min。

用高效液相色譜法測定七清敗毒顆粒中黃芩苷含量的方法，簡便、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，為進(jìn)一步控制七清敗毒顆粒的質(zhì)量提供了依據(jù)。